Les cellules de l'hippocampe séparent les engrammes positifs et négatifs

Jun 13, 2023

Biologie des communications volume 5, Numéro d'article : 1009 (2022) Citer cet article

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L'hippocampe est impliqué dans le traitement d'une variété de calculs mnémoniques, en particulier les composants spatio-temporels et les dimensions émotionnelles de la mémoire contextuelle. Des études récentes ont démontré une hétérogénéité cellulaire le long de l'axe hippocampique. L'hippocampe ventral s'est avéré important dans le traitement de l'émotion et de la valence. Ici, nous combinons des stratégies de marquage dépendantes de l'activité transgéniques et basées sur tous les virus pour visualiser plusieurs engrammes spécifiques à la valence dans le vHPC et démontrer deux populations de cellules partiellement séparées et des projections qui répondent aux expériences appétitives et aversives. Ensuite, en utilisant des approches de séquençage de l'ARN et de séquençage de la méthylation de l'ADN, nous constatons que les cellules d'engrammes vHPC appétitives et aversives présentent différents programmes de transcription et paysages de méthylation de l'ADN par rapport à une population d'engrammes neutres. De plus, la manipulation optogénétique des corps cellulaires marqués dans vHPC n'est pas suffisante pour entraîner un comportement appétitif ou aversif dans la préférence de lieu en temps réel, la stimulation des terminaux vHPC marqués se projetant vers l'amygdale et le noyau accumbens (NAc), mais pas le cortex préfrontal (PFC) , a montré la préférence et l'évitement du lecteur de capacité. Ces terminaux ont également pu modifier leur capacité à conduire le comportement. Nous concluons que le vHPC contient des populations génétiquement, cellulairement et comportementalement séparées de cellules traitant des engrammes de mémoire appétitifs et aversifs.

Dans le cerveau, nous trouvons un riche référentiel de souvenirs qui peuvent être imprégnés d'informations positives et négatives de valence1,2,3. Ces expériences laissent des changements structurels et fonctionnels durables4 qui sont morcelés en1,5,6,7,8,9 ensembles discrets de cellules et de circuits comprenant l'engramme de mémoire10. Des études récentes ont visualisé et manipulé avec succès des ensembles définis de cellules précédemment actives au cours d'une seule expérience10,11,12,13,14,15,16,17. Cependant, la manière dont plusieurs engrammes de valences variables (ci-après définis comme des cellules qui répondent de manière différentielle à des événements appétitifs ou aversifs d'une manière indépendante du stimulus) sont représentés dans la même région cérébrale reste mal comprise. Des études antérieures ont suggéré que l'hippocampe ventral (vHPC) délimite et relaie sélectivement les informations émotionnelles vers diverses cibles en aval. Nous avons cherché à caractériser les identités moléculaires et cellulaires et les fonctions comportementales des cellules vHPC traitant les engrammes appétitifs et aversifs, en mettant l'accent sur le CA1 ventral (vCA1). Afin de répondre à la question de savoir comment le vCA1 traite plusieurs expériences émotionnelles, nous avons d'abord conçu une stratégie combinant deux méthodes de marquage basées sur cFos avec une immunohistochimie cfos endogène pour visualiser les engrammes à travers trois points de temps discrets. Tout d'abord, nous avons cartographié anatomiquement les schémas de projection des cellules vCA1 étiquetées de manière appétitive et aversive pour mesurer le chevauchement structurel et la ségrégation sur diverses cibles en aval. Deuxièmement, nous avons effectué un séquençage de l'ARN à l'échelle du génome (RNA-seq) et un séquençage de la méthylation de l'ADN pour étudier les caractéristiques génétiques de ces ensembles de cellules. Enfin, nous avons testé comportementalement le rôle causal et la flexibilité fonctionnelle des cellules vHPC à la fois dans un corps cellulaire et de manière spécifique à la projection.

Tout d'abord, pour accéder aux cellules à plusieurs moments et d'une manière dépendante de l'activité et intra-sujet, nous avons utilisé l'animal transgénique à base de Fos, TRAP218, sous le contrôle du 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) associé à un Fos tout virus. -stratégie à base de doxycycline10 (Dox) (Fig. 1a). Les souris TRAP2 + exprimant la recombinase iCre-ERT2, lorsqu'elles sont injectées avec du DMSO au lieu de 4-OHT, ne montrent aucune expression de TdTomato (Fig. 1 supplémentaire), ont été injectées bilatéralement avec un cocktail de virus : AAV9-Flex-DIO-TdTomato et AAV-cFos -tTA + AAV-TRE-EYFP. La stratégie cfos-tTA couple le promoteur c-Fos au transactivateur de la tétracycline (tTA), qui, sous sa forme protéique, se lie directement à l'élément de réponse à la tétracycline (TRE) de manière dépendante de la doxycycline (Dox) et pilote l'expression d'une protéine d'intérêt (ie EYFP). La combinaison de ces deux systèmes indépendants donne deux fenêtres inductibles pour le marquage des cellules vHPC au sein du même sujet (voir Méthodes).

a Des souris Fos-CreERT2 ont été injectées avec un cocktail viral de rapport 1: 1 d'AAV9-c-Fos-tTA et d'AAV9-TRE-EYFP mélangés à 1: 1 avec AAV-Flex-DIO-TdTomato dans le vHPC pour créer le possibilité d'ouvrir deux fenêtres de marquage à la souris. b Schéma de la chronologie pour TAG1 et TAG2 qui dépendent respectivement de la doxycycline et du 4-hydroxytamoxifène. L'étiquette aversive consiste en des chocs de 4 pieds et l'étiquette appétitive consiste en une exposition homme à femme. c Image représentative de la ségrégation à double mémoire dans une coupe sagittale du vHPC, en particulier vCA1. d Quantification (%Labeling) des cellules EYFP + (aversives) et TdTomato + (appétitives) sur DAPI le long de l'axe antéro-postérieur de vCA1 montrant la ségrégation de la valence. (N = 3) e Schéma pour visualiser les cellules actives au cours de trois expériences comportementales différentes. TAG1 est dépendant de la doxycycline dans EYFP, TAG2 est dépendant de 4-OHT dans TdTomato, et enfin, TAG3 est visualisé par immunohistochimie en colorant les cfos endogènes 90 minutes après une expérience comportementale. f Schéma des groupes pour visualiser les chevauchements de mémoire triple (n = 4–6 par groupe). Les groupes ont été contrebalancés pour éviter les biais de chronologie potentiels g Images représentatives des chevauchements de mémoire triple dans vCA1 avec un zoom 20x montrant les différents chevauchements représentatifs. h Le nombre de neurones marqués dans vCA1 est similaire entre EYFP, TdTomato et cfos ; il n'y a pas de différence statistique entre les recrutements. (Comparaisons multiples à sens unique Anova ; N = 10–12) i, Pourcentage de chevauchement pour les balises comportementales respectives pour EYFP + Tdtomato pour aversif + appétitif (Groupe 1), aversif + aversif (Groupe 2), appétitif + aversif (Groupe 3) , et appétitif + appétitif (Groupe4), (F (3, 12) = 170,0, P < 0,0001). j Différence NS dans les cellules qui se chevauchent cfos + EYFP dans le stress de contention + le choc par rapport au lait concentré sucré + l'exposition des femmes. k, des valences similaires aversif et stress et appétit et lait se chevauchent fortement par rapport au chevauchement de différentes valences, appétit et stress et aversif et lait. ANOVA unidirectionnelle à comparaisons multiples ; F (3, 12) = 20,77, P < 0,0001. l Nombre de chevauchements triples pour EYFP + TdTomato + cfos (F (3, 12) = 10,55, ns, non significatif p > 0,05, P = 0,0011 ; les barres d'erreur représentent la moyenne ± la moyenne d'erreur standard (SEM).

Après avoir injecté le cocktail de virus susmentionné dans le vHPC, nous avons utilisé ce système de marquage double pour étiqueter les cellules traitant des engrammes appétitifs ou aversifs. Dix jours après la chirurgie et la récupération, les souris ont été retirées de leur régime alimentaire DOX pendant 48 heures pour ouvrir la première fenêtre de marquage. Pendant qu'elles n'étaient pas sous DOX, pour marquer l'expérience d'appétit, les souris ont été exposées aux femelles pendant 1 heure dans une cage à domicile propre13,19 et ont été immédiatement remises sous régime DOX pour le reste de l'étude. Pour marquer l'expérience aversive, le deuxième ensemble de cellules, 24 heures plus tard, des souris mâles ont été soumises à quatre chocs de pied de 2 s et 1,5 mA. 30 minutes après la fin du conditionnement de la peur, les souris ont reçu une injection de 40 mg/kg de 4-OHT et ont été laissées au repos pendant 72 heures (Fig. 1b). Nous avons d'abord observé une distinction anatomique frappante entre les engrammes appétitifs et aversifs le long de l'axe antérieur et postérieur dans les coupes sagittales de vCA1 (Fig. 1c). Les cellules engrammes appétitives étaient principalement situées dans les sections plus postérieures, tandis que les cellules engrammes aversives étaient largement présentes dans les sections antérieures de vCA1, avec un motif sel et poivre observé dans les sections médiales (Fig. 1c, d). Nous avons constaté que l'ordre de marquage, le choc de marquage puis l'exposition des femmes n'avaient pas d'impact sur le recrutement anatomique de ces cellules (Fig. 2 supplémentaire).

Ensuite, en utilisant la même stratégie de double étiquetage que celle décrite ci-dessus, nous avons demandé si ces populations étiquetées appétitives et aversives avaient été recrutées ou non lors d'expériences ultérieures de valences similaires. À cette fin, nous avons ajouté un troisième point en visualisant l'expression endogène de cFos 90 minutes après une expérience comportementale finale, c'est-à-dire une exposition au lait concentré sucré ou un stress de contention20,21,22,23 (Fig. 1e, f). Pour contrôler l'ordre des expériences, nous avons contrebalancé les quatre groupes, chacun contenant deux populations de cellules étiquetées (c'est-à-dire aversives pour les cellules étiquetées par le conditionnement de la peur et appétitives pour les cellules étiquetées par les interactions homme-femme), suivies d'une troisième expérience de la valence, le stress de retenue comme un autre lait condensé aversif et sucré comme l'autre expérience appétitive, qui a été capturée par l'expression endogène de cFos. Nos groupes étaient les suivants : Stress Aversif-Appétitif-Retenue (GROUPE 1), Stress Aversif-Aversif-Retenue (GROUPE 2), Lait Condensé Appétitif-Aversif-Sucré (GROUPE 3) et Lait Condensé Appétitif-Appétitif-Sucré (GROUPE 4 ) comme le montre la figure 1f. Dans chaque groupe, nous avons mesuré la co-localisation cellulaire de TdTomato, EYFP et cFos pour déduire quelles cellules étaient actives dans une ou plusieurs des trois expériences (Fig. 1g). Toutes les souris présentaient une proportion similaire de cellules marquées dans les trois approches de marquage, quelle que soit la méthode de marquage ou la valence (Fig. 1h et Fig. 3 supplémentaire).

Des analyses histologiques ont révélé qu'il y avait des taux significativement plus élevés de cellules présentant une co-localisation de TdTomato et EYFP lorsqu'elles étaient étiquetées avec les mêmes expériences (c'est-à-dire appétitives et appétitives) et des taux de co-localisation plus faibles lors de l'étiquetage d'expériences de valence différente (c'est-à-dire appétitives et aversives) dans Fig. 1i. De plus, nous avons observé une colocalisation significative entre TdTomato, EYFP et cFos lorsque les souris ont été soumises à trois expériences aversives ou trois expériences appétitives (Fig. 1l), c'est-à-dire GROUPE 2 et GROUPE 4 respectivement. Les cellules marquées par l'appétit étaient préférentiellement réactivées lorsque les souris étaient exposées à du lait concentré sucré, et les cellules marquées par l'aversion étaient préférentiellement réactivées lorsque les souris étaient exposées à un stress de contention (Fig. 1j, k). Ensemble, ces découvertes soulèvent la possibilité intrigante que vCA1 désigne des informations émotionnellement pertinentes pour deux ensembles de cellules partiellement non chevauchants.

À l'avenir, nous avons choisi deux engrammes valenciés, le choc et l'exposition homme-femme, comme proxy pour mieux comprendre comment le vHPC traite ces expériences aversives et appétitives. Par conséquent, nous avons utilisé les mêmes stratégies de double marquage pour caractériser les propriétés physiologiques de base des cellules vHPC (Fig. 4 supplémentaire). Des souris TRAP2 ont été co-injectées avec les mêmes virus dépendants de l'activité et étiquetées de la même manière que mentionnée précédemment (Fig. 4a, b supplémentaires). Fait intéressant, nous n'avons observé aucune différence dans la fréquence de tir, la caractérisation supraseuil, le taux d'adaptation, le taux d'entrée ou les taux de pointe (Fig. 4c – l supplémentaire), ce qui suggère que, malgré le recrutement d'ensembles de cellules partiellement non chevauchants pour des expériences appétitives et aversives, ces cellules marquées elles-mêmes partagent des caractéristiques physiologiques similaires.

Malgré ces similitudes physiologiques, il a été démontré que les cellules vHPC se projettent sur une myriade de régions cérébrales distinctes impliquées dans le stress et les comportements d'évitement d'approche, formant ainsi des réseaux multirégionaux impliquant l'émotion et la mémoire1. Nous avons émis l'hypothèse qu'au sein de ces réseaux, il existe une hétérogénéité structurelle en partie définie par le fait qu'une expérience est valentitivement ou aversement, comme cela a été observé dans des domaines tels que l'amygdale10,24,25, le noyau accumbens26 et le cortex préfrontal médial27. En utilisant notre stratégie de marquage double, nous avons ensuite tracé les sorties vHPC marquées par des expériences d'appétit et de choc de manière intra-sujet et mesuré les intensités de fluorescence axonale dans les zones cibles suivantes, compte tenu de leur rôle crucial dans le traitement émotionnel : BLA, NAc, PFC, dorsal l'hypothalamus, le fornix et le gyrus denté (Fig. 2a, b). Fait intéressant, nous avons observé à la fois un signal fluorescent rouge et vert entre les terminaux vCA1 étiquetés appétitifs et aversifs dans le BLA médian (AP -1,8) et le PFC (y compris IL et PL), tout en trouvant des preuves de ségrégation structurelle dans les régions suivantes : nous observé des projections EYFP (appétitives) principalement plus fortes, mesurées par les intensités de fluorescence, sur la partie postérieure de l'amygdale basomédiale (BMP), la partie antérieure de la commissure antérieure (ACA), le fornix, le noyau hypothalamique médial dorsal (DMD et DMV), et la couche inférieure de le gyrus denté (Fig. 2c–o). De plus, nous avons trouvé des projections TdTomato (aversives) principalement plus fortes vers le BLA antérieur, le BLA postérieur, le noyau NAc et la couche supérieure du DG (Fig. 2c – o). Des études antérieures ont démontré que les neurones dans des régions telles que PFC27, NAc26 et BLA10.25, traitent collectivement les expériences d'une manière qui peut être anatomiquement séparée ou hétérogène. Nous postulons que les terminaux vHPC étiquetés appétitifs et aversifs sont intégrés dans un réseau plus large de traitement de la mémoire émotionnelle qui peut être en partie défini à la fois par des modèles anatomiques uniques et par le recrutement dépendant de l'activité d'ensembles impliqués dans le traitement d'une valence spécifique.

a Des souris Fos-CreERT2 ont reçu une injection d'un cocktail viral de rapport 1: 1 d'AAV9-c-Fos-tTA et d'AAV9-TRE-EYFP mélangé avec AAV-Flex-DIO-TdTomato dans le vHPC pour un marquage à double mémoire. b Calendrier expérimental pour le marquage ; EYFP représente aversif et TdTomato représente appétitif. c, d Images représentatives des projections terminales ; BLA antérieur, médial et postérieur, l'hippocampe dorsal, le cortex préfrontal, le noyau accumbens, le noyau hypothalamique dorsal médial et le fornix. Unités arbitraires pour EYFP (appétitif) et TdTom (aversif) (N = 3) pour le e, BLA antérieur (test t de l'étudiant non apparié t = 7,279, df = 4, p = 0,00019), f BLA médial (t = 1,271, df = 4 ; p = 0,2725), g, BLA postérieur (t = 14,95, df = 4 ; p = 0,0001), h, BMP (t = 6,168, df = 4 ; p = 0,0035), i, PFC (inclut IL et PL) (t = 1,078, df = 4 ; p = 0,3419), j, ACA (t = 50,68, df = 4 ; P < 0,0001), k, NAc Core (t = 3,018, df = 4 ; p = 0,0392 ), l, fornix (t = 5,718, df = 4 ; p = 0,0046), m, hypothalamus t = 13,96, df = 4 ; p = 0,0002, n, couche supérieure de DG (t = 54,94, df = 4 ; p < 0,0001), o, couche inférieure de DG (t = 11,73, df = 4 ; p = 0,0003). ns = p > 0,05. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± SEM. Les barres d'échelle sont toutes de 100 μm.

Des études récentes ont identifié des profils moléculaires uniques de cellules vCA1 contenant des cibles de projection distinctes. Ces projections vCA1 transmettent des informations à de multiples zones impliquées dans l'émotion et la mémoire et forment un réseau qui peut être organisé par des caractéristiques architecturales uniques, y compris les entrées, les sorties et les signatures transcriptionnelles des cellules vCA1. Nous voulions poser la question de savoir si les populations cellulaires dans leur ensemble, pour les engrammes appétitifs ou aversifs, ont des différences génétiques distinctes basées sur l'expérience. En conséquence, nous avons ensuite examiné si oui ou non la composition moléculaire des cellules vHPC contenait des profils génétiques distincts. Pour cataloguer le paysage moléculaire des cellules vHPC de manière dépendante de l'activité, nous avons étiqueté une expérience appétitive (c'est-à-dire des interactions homme-femme), une expérience aversive (c'est-à-dire des chocs multiples) ou une expérience neutre (c'est-à-dire une exposition à la même cage de conditionnement sans un stimulus appétitif ou aversif, voir méthodes, Fig. 3a). Nous avons ensuite effectué un séquençage d'ARN à l'aide de noyaux marqués (EYFP +) isolés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), qui a montré environ 0, 6% de noyaux marqués des groupes appétitif et aversif, alors que le neutre a recruté en moyenne 0, 35% de noyaux EYFP + ( Fig. 3b, c). Les groupes appétitifs et aversifs ont recruté significativement plus de noyaux EYFP + que le groupe d'expérience neutre (Fig. 3c). En comparant les cellules vCA1 aversives et appétitives au groupe neutre, nous avons identifié 474 gènes exprimés de manière différentielle (DEG) dans les cellules vCA1 aversives (Fig. 3d, f), dont 340 gènes régulés à la baisse et 134 gènes régulés à la hausse (Fig. 3g). Nous avons également identifié 1 104 DEG dans les cellules vCA1 appétitives par rapport au groupe neutre (Fig. 3e, f), dont 1 025 gènes régulés négativement et 79 gènes régulés positivement (Fig. 3g). Il y avait 842 DEG uniques dans les cellules engrammes appétitives et 212 DEG uniques dans les cellules engrammes aversives (Fig. 3f), suggérant des paysages transcriptionnels distincts dans ces deux populations.

un schéma expérimental pour étiqueter, isoler et analyser les deux groupes de cellules vCA1 marquées par EYFP lors d'une stimulation aversive (choc électrique) ou d'une stimulation appétitive (souris mâles engagées dans une interaction sociale avec des souris femelles) ou d'un conditionnement neutre dans la même cage sans aversion ou stimulation appétitive. b Isolement FACS des noyaux EYFP-appétitifs de l'hippocampe de souris marquées par le virus AAV9-cFos-tTA + AAV9-TRE-ChR2-EYFP de leurs groupes respectifs c, Pourcentage de noyaux EYFP-appétitifs de chaque groupe (N = 3 par groupe /timepoint, ANOVA unidirectionnelle ordinaire, comparaisons multiples ***P = 0,001, ****P < 0,0001, ns = non significatif, p > 0,05). d Un graphique Volcano avec le changement relatif de l'expression génique dans le rapport log 2 et la valeur p ajustée au FDR dans le rapport log 2 en tant qu'axes X et Y montrant les gènes régulés à la hausse et à la baisse dans les cellules vCA1 aversives par rapport au groupe neutre. Les gènes régulés à la hausse ou à la baisse avec une valeur de p ajustée au FDR inférieure à 1e-5 plus des différences d'au moins quatre fois ont été mis en évidence en rouge ou en bleu respectivement. Les noms de gènes ont été affichés pour les 20 gènes les plus significatifs, triés par les statistiques de Wald. e Un graphique Volcano montrant les gènes régulés positivement et négativement dans les cellules vCA1 appétitives par rapport au groupe neutre. f Un diagramme de Venn montrant les 1104 gènes différentiellement exprimés (DEG) dans les cellules appétitives et 474 DEG dans les cellules vCA1 aversives. 262 DEG ont été identifiés dans les deux groupes. g Un graphique UpSet montrant 226 gènes régulés négativement dans les cellules vCA1 aversives et appétitives, et 35 gènes régulés positivement dans les cellules vCA1 aversives et appétitives. Un seul gène (Nufip1) était régulé positivement dans l'engramme appétitif mais régulé négativement dans l'engramme aversif. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± SEM.

De plus, les 20 premiers DEG régulés à la baisse identifiés pour les cellules vCA1 aversives et appétitives n'ont montré aucun chevauchement les uns avec les autres, et 14 parmi les 20 premiers DEG régulés à la hausse pour les cellules vCA1 aversives et appétitives ne se chevauchent pas (Fig. 3d, e, Tableaux supplémentaires 1 et 2), soutenant les transcriptomes distincts dans ces neurones. Fait intéressant, parmi les 262 DEG partagés, nous avons identifié un gène Nufip1 (Nuclear Fragile X Mental Retardation Protein Interacting Protein 1) qui était régulé positivement dans les cellules vCA1 appétitives et régulé négativement dans les cellules vCA1 aversives (Fig. 3g). Ce gène code pour une protéine de liaison à l'ARN nucléaire qui contient un motif à doigt de zinc C2H2 et un signal de localisation nucléaire28. Les maladies associées aux mutations NUFIP1 comprennent le syndrome de Peho (encéphalopathie progressive avec œdème, hypsarythmie et atrophie optique), un trouble neurodégénératif autosomique récessif et dominant, progressif qui débute au cours des premières semaines ou des premiers mois de la vie. Sa protéine d'interaction FMRP1 est essentielle pour la synthèse des protéines dans la synapse29 et la mutation d'expansion des trinucléotides CGG du gène FMR1 codant pour FMRP1 provoque le syndrome de l'X fragile, la déficience intellectuelle la plus courante chez les hommes30. Une enquête plus approfondie sur la signification fonctionnelle de NUFIP1 et d'autres DEG pourrait révéler des informations mécanistes sur la plasticité transcriptomique engagée par les valences de la mémoire.

Pour mieux comprendre les signatures moléculaires des transcriptomes associés aux cellules vCA1 aversives et appétitives, nous avons effectué une analyse Gene Ontology (GO) des voies régulées à la hausse et à la baisse dans les cellules vCA1 aversives et appétitives (Fig. 4a – d). Nous avons constaté que la voie régulée à la hausse dans les cellules vCA1 aversives impliquait des complexes de neurotransmetteurs tels que l'activité des récepteurs ionotropes du glutamate (Fig. 4a). Cette découverte est cohérente avec des études antérieures utilisant des tissus cérébraux qui ont identifié 3 759 régions d'ADN méthylées de manière différentielle dans l'hippocampe associées à 1 206 gènes enrichis dans les catégories d'activité des canaux ioniques après conditionnement contextuel de la peur29,31,32. Fait intéressant, nous avons découvert que la voie de régulation négative supérieure dans les cellules vCA1 aversives impliquait la réparation des mésappariements d'ADN (Fig. 4b). Bien que les voies les plus régulées à la hausse dans les cellules vCA1 appétitives incluent également l'activité du récepteur ionotropique du glutamate (Fig. 4c), les voies les plus régulées à la baisse dans les cellules vCA1 appétitives s'enrichissent lors de l'assemblage des axonèmes et de la formation de faisceaux de microtubules (Fig. 4d) différentes des voies régulées à la baisse dans le vCA1 appétitif. cellules (Fig. 4b). Ensuite, nous avons comparé directement les données d'ARN-seq entre les cellules vCA1 aversives et appétitives. Nous avons identifié 494 DEG, dont 47 gènes régulés positivement et 447 gènes régulés négativement (Fig. 5a supplémentaire et Tableau supplémentaire 3). De plus, nous avons constaté que cinq voies étaient régulées à la hausse dans les cellules vCA1 appétitives telles que le complexe ARNase de l'exosome nucléaire et 16 voies étaient régulées à la baisse dans l'engramme appétitif par rapport aux cellules vCA1 aversives, telles que l'assemblage d'axonèmes Fig. 5b, c). Ces voies de signalisation modifiées de manière différentielle entre les cellules vCA1 aversives et appétitives, résultant de comparaisons multiples, étayent notre conclusion selon laquelle ces neurones représentent en effet des sous-populations transcriptionnellement distinctes. Une direction future consiste à explorer les fonctions de ces DEG et les voies de signalisation modifiées. En tant que preuve de concept, nous avons appliqué GeneMANIA33 pour prédire les fonctions des 20 premiers DEG de la Fig. 4e – h. Par exemple, l'inhibiteur de l'angiogenèse spécifique au cerveau 2 (BAI2) est identifié de manière unique pour les DEG régulés positivement dans les cellules vCA1 aversives (Fig. 4e), et le récepteur ionotropique du glutamate n'est impliqué que pour les DEG régulés positivement dans les cellules vCA1 appétitives (Fig. 4g ). De même, le composant de la voie de signalisation WNT Disheveled est identifié de manière unique pour les DEG régulés à la baisse dans les cellules vCA1 aversives (Fig. 4f), et le canal TRPV1-4 n'est impliqué que pour les DEG régulés à la hausse dans les cellules vCA1 appétitives (Fig. 4h). L'étude de la fonction de perte et de gain de ces gènes prédits fournira un aperçu mécaniste des signatures moléculaires des neurones engrammes avec différentes valences de mémoire.

une analyse d'ensemble d'enrichissement de gènes des voies régulées positivement dans les engrammes aversifs à l'aide du module Gene Ontology (GO). La taille du point représente le nombre de gènes et la couleur du point indique le FDR. La voie avec une valeur P ajustée au FDR inférieure à 0,25 est considérée comme significativement enrichie. b Analyse GO des voies régulées à la baisse dans les cellules vCA1 aversives. c Analyse GO des voies régulées positivement dans les cellules vCA1 appétitives. d Analyse GO des voies régulées à la baisse dans les cellules vCA1 appétitives. Réseau GeneMANIA des 20 principaux gènes régulés à la hausse et à la baisse dans les cellules vCA1 aversives et appétitives, respectivement. Les gènes avec des nœuds rouges sont régulés à la hausse e, ou à la baisse f, dans les cellules vCA1 aversives par rapport à l'échantillon neutre, et les gènes avec des nœuds verts sont régulés à la hausse (g) ou à la baisse (h) dans le vCA1 appétitif par rapport à l'échantillon neutre. Les nœuds gris représentent les gènes interagissant avec ces 20 gènes différentiellement exprimés. Les domaines protéiques partagés pris en charge par les bases de données de domaines InterPro au sein de chaque réseau ont été marqués en rouge pour les cellules vCA1 aversives et en vert pour les cellules vCA1 appétitives. La description détaillée de chaque domaine protéique partagé est répertoriée dans le tableau supplémentaire 4. Les catégories de réseau d'interaction entre ces gènes sont annotées dans la légende à côté du panneau g.

Outre les profils transcriptomiques distincts dans les neurones à engramme décrits ci-dessus, des études récentes révèlent le rôle d'amorçage transcriptionnel de la régulation épigénétique dans l'engramme34. Pour explorer si le paysage épigénomique dynamique contribue également à la spécificité des neurones engrammes avec différentes valences, nous avons effectué un séquençage au bisulfite à représentation réduite (RRBS) pour caractériser les paysages de méthylation de l'ADN dans les cellules vCA1 aversives et appétitives. Comme le montre la Fig. 5a, b, nous avons identifié 1939 cytosines différentiellement méthylées (DMC) avec un changement de méthylation de l'ADN supérieur à 20% et une valeur p inférieure à 0,05 dans les cellules vCA1 aversives par rapport au groupe neutre, et 3117 DMC dans vCA1 appétitif. cellules. Ces DMC sont situés dans les différentes positions du génome, notamment 5'UTR, promoteur, exon, intron, 3'UTR, sites de terminaison de la transcription (TTS), régions intergéniques non codantes, suggérant différentes sorties fonctionnelles au niveau transcriptionnel. Fait intéressant, les distributions génomiques de ces DMC dans les cellules vCA1 aversives sont légèrement différentes de celles de vCA1 appétitif (tableau supplémentaire 5). Sur la base de ces DMC, nous avons identifié des régions différentiellement méthylées (DMR) contenant au moins deux DMC pour chaque DMR (Fig. 5c, d). Ces DMR nous permettent d'identifier les gènes différentiellement méthylés (DMG) qui contiennent ou sont proches de ces DMR. Les 20 premiers DMG avec un changement de niveau de méthylation supérieur à 20 % et une valeur p inférieure à 0, 05 ne montrent aucun chevauchement entre les cellules vCA1 aversives et appétitives, ce qui suggère que différentes valences de mémoire déclenchent différents changements de méthylations de l'ADN. Parmi les 266 DMG dans les cellules vCA1 appétitives et les 98 DMG dans les cellules vCA1 aversives, seuls 32 DMG sont communément partagés (Fig. 5e, Données supplémentaires 1), confirmant le paysage distinct de méthylation de l'ADN entre ces deux populations de cellules engrammes. Enfin, nous avons effectué une analyse Gene Ontology (GO) des DMG dans des cellules vCA1 aversives et appétitives (Fig. 5f, g). Nous avons constaté que les voies des cellules vCA1 aversives s'enrichissaient principalement dans la structure et la fonction des connexions synaptiques (Fig. 5f). Cependant, les voies enrichies dans les cellules vCA1 appétitives sont beaucoup plus diverses, notamment la croissance des axones, la connexion synaptique, les canaux ioniques et le complexe régulateur de transcription de l'ARN polymérase II (Fig. 5g). Ces voies différentiellement enrichies entre les cellules vCA1 aversives et appétitives suggèrent des sorties fonctionnelles potentiellement distinguées attribuées par la méthylation de l'ADN au niveau transcriptionnel pour conférer la spécificité des valences de la mémoire. Une direction future intéressante consiste à explorer le maintien et les fonctions de ces changements de méthylation de l'ADN lors de la consolidation et du rappel de la mémoire. Dans l'ensemble, nos résultats dans les Figs. 3, 4 et 5 ont montré que les signatures moléculaires distinctes des cellules vCA1 aversives et appétitives se reflètent aux niveaux transcriptomique et épigénomique, contribuant probablement aux différentes valences de la mémoire.

Parcelles volcaniques montrant les cytosines différentiellement méthylées (DMC) avec un changement de méthylation de l'ADN supérieur à 20 % et une valeur p inférieure à 0,05 dans les cellules vCA1 aversives ou b appétitives par rapport au groupe neutre. Les DMC dans différentes positions génomiques (3'UTR, 5'UTR, exon, intergénique, intron, promoteur non codant, TSS) sont codés par couleur. Parcelle de volcan montrant des régions méthylées différemment (DMR) qui contiennent au moins deux DMC pour chaque DMR dans les cellules aversives c et appétitives d, vCA1. Les 10 premières régions hyperméthylées et hypométhylées ont été mises en évidence en rose ou en bleu séparément et ont été annotées à ses gènes les plus proches. e Un diagramme de Venn montrant des gènes méthylés différemment (DMG) qui sont associés aux DMR en c et d identifiés dans les cellules vCA1 aversives et appétitives. f, analyse GO des DMG dans les cellules vCA1 aversives. g Analyse GO des DMG dans les cellules vCA1 appétitives.

vCA1 est connu pour avoir des projections monosynaptiques vers le BLA, le NAc et le mPFC35. Des études antérieures ont montré que ces régions cérébrales sont importantes dans la modulation des expériences appétitives et aversives, en particulier dans le NAc26,36 et le BLA24,37, dans lesquels des populations cellulaires moléculairement et topographiquement distinctes ont été identifiées pour chaque comportement. Par conséquent, nous avons testé le rôle causal des corps cellulaires vHPC marqués et de ses terminaux sélectionnés dans le comportement de conduite en infusant d'abord un cocktail de virus AAV9-cFos-tTA et AAV9-TRE-ChR2-EYFP ou AAV9-TRE-EYFP dans vCA1. Nous avons ensuite implanté une fibre optique bilatéralement au-dessus du vCA1 ou de ses bornes, vCA1-BLA, vCA1-NAc, vCA1-PFC (Fig. 6a). Nous avons d'abord constaté que tous les terminaux étaient capables d'activer leurs cibles en aval correspondantes en évaluant les augmentations des niveaux de cFos après stimulation (Fig. 6 supplémentaire). Après 10 jours de récupération, un groupe séparé de souris a été retiré de DOX et marqué avec des expériences aversives (c'est-à-dire un choc) ou appétitives (c'est-à-dire des interactions mâle-femelle). Comme illustré sur la figure 6b, pour la première série d'expériences, le jour 1, les souris marquées de manière agressive ont été placées dans une chambre de préférence/évitement de lieu en temps réel (RTPP/A) le jour 1 pour évaluer les niveaux de base. Au jour 3, les animaux ont été replacés dans la chambre PTPP/A ; cette fois, ils ont reçu une stimulation optique à 20 Hz bilatéralement d'un côté et aucune stimulation de l'autre. Nous avons constaté que la stimulation optique des terminaux vCA1 – BLA ou vCA1 – NAc conduisait à l'aversion (Fig. 6e, f), alors que les contrôles EYFP, la stimulation du corps cellulaire vCA1 et les terminaux vCA1-PFC ne s'écartaient pas statistiquement des niveaux de base (Fig. 6c). , d, g). Au jour 5 de l'expérience, les souris ont été soumises à un protocole d'induction, comme indiqué précédemment13, pour tester la capacité de l'engramme à changer le comportement qu'il induit. Les souris mâles étiquetées aversives ont été placées dans une nouvelle chambre avec une souris femelle pendant 10 minutes tout en recevant une stimulation optique pendant toute la durée de l'exposition. Ensuite, les animaux ont été replacés dans leurs chambres et évalués pour les changements de comportement au jour 7. Dans ce test de post-induction, nous avons observé que la stimulation optique des terminaux vCA1-BLA était maintenant suffisante pour conduire la préférence malgré l'aversion de conduite dans la pré-induction tester plus tôt (Fig. 6e). Le protocole d'induction a également révélé que les terminaux vCA1 – NAc, qui étaient auparavant suffisants pour provoquer l'aversion, avaient maintenant inversé ou réinitialisé leur capacité à moduler le comportement et étaient revenus aux niveaux de base (Fig. 6g). Enfin, nous n'avons constaté aucun changement dans les contrôles EYFP, le corps cellulaire vCA1 ou la stimulation vCA1 – PFC (Fig. 6c, d, g).

Des souris ont été injectées avec un cocktail de virus d'AAV9-c-Fos-tTA AAV9-TRE-ChR2-EYFP ou AAV9-TRE-EYFP dans vCA1 et des fibres optiques ont été placées bilatéralement sur les corps cellulaires de vCA1 ou les terminaux de vCA1 à la BLA , Nacc, ou le PFC, dans des groupes séparés. Les souris ont ensuite été étiquetées avec une expérience aversive ou appétitive et soumises à un évitement et à une préférence opto-place en temps réel. a Images représentatives des corps cellulaires d'étiquetage ChR2-EYFP dans vCA1 et ses terminaux respectifs dans le BLA, NAcc et PFC. b Peur pour récompenser le protocole dans lequel les sujets ont reçu une stimulation du corps cellulaire vCA1 ou des projections vCA1 vers les terminaux BLA, NAcc ou PFC. c–g Pourcentage de préférence pour le côté stimulation au départ, avant et après l'induction (n = 7 sujets pour les contrôles EYFP, n = 8 sujets pour vCA1, n = 8 sujets pour BLA, n = 7 pour NAcc et n = 7 pour PFC, **P = 0,0018, ***P = 0,0006, ANOVA unidirectionnelle à mesures répétées suivie du test de comparaison multiple de Tukey). h Protocole de récompense à la peur dans lequel les sujets ont reçu une stimulation des terminaux BLA, NAcc ou PFC provenant de vCA1. i–m, Pourcentage de préférence pour le côté stimulation au départ, avant et après l'induction (n = 7 pour EYFP, n = 9 pour vCA1, n = 8 pour BLA, n = 7 pour NAcc et n = 7 pour PFC, ns = p > 0,05, ** P = 0,0032, **** P < 0,0001, ANOVA unidirectionnelle à mesures répétées suivie du test de comparaison multiple de Tukey. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± SEM.).

Ensuite, nous avons demandé si les terminaux vCA1 étiquetés appétitifs au BLA, NAc ou PFC étaient suffisants pour moduler le comportement (Fig. 6h). Semblable aux résultats ci-dessus, la stimulation optique des terminaux vCA1 – BLA (Fig. 6k) et vCA1-NAc (Fig. 6l), mais pas dans aucun des autres groupes (Fig. 6i, j, m), était suffisante pour conduire préférence de lieu. Au cours de la phase d'induction de l'expérience, nous avons placé les souris dans une chambre de conditionnement de la peur où elles ont reçu plusieurs chocs au pied et une stimulation optique simultanée des terminaux marqués par l'appétit. Cette expérience a évalué si ces terminaux vCA1 sont capables de changer ou de réinitialiser leur capacité à piloter la préférence d'une manière reflétant les expériences ci-dessus. En effet, nous avons constaté que dans les tests post-induction, le groupe vCA1 – BLA passe de la préférence de conduite à l'aversion (Fig. 6k) tandis que le groupe vCA1 – NAc revient de la préférence de conduite aux niveaux de référence (Fig. 6l). De plus, nous n'avons pas observé cet effet chez les animaux étiquetés neutres (Fig. 7 supplémentaire), et nous n'avons pas non plus observé de changements de comportement statistiquement significatifs pour la tâche RTPP / A chez les témoins EYFP, le groupe de stimulation du corps cellulaire vCA1 ou vCA1 – PFC. groupe de stimulation (Fig. 6i, j, m). Il est important de noter que nous avons testé si la stimulation optique pouvait entraîner une augmentation des comportements moteurs. Nous n'avons trouvé aucune différence significative dans la distance parcourue entre tous les groupes pendant les périodes d'éclairage allumé ou éteint dans un champ ouvert (Fig. 8 supplémentaire). De plus, le manque de préférence ou d'évitement observé à partir de la stimulation du corps cellulaire vCA1 a soulevé la possibilité que le rôle de vCA1 dans le comportement de conduite soit déterminé d'une manière spécifique au terminal35 ; une notion qui concorde avec des études récentes suggérant que les calculs le long des axones d'un corps cellulaire donné peuvent conduire différemment le comportement en fonction de la cible en aval8. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les corps cellulaires vHPC relaient leur contenu pertinent sur le plan comportemental et spécifique à la valence à ses cibles en aval malgré le partage de signatures moléculaires et neuronales partiellement non chevauchantes et de modèles de projection distincts. Ceci est corroboré par des preuves montrant que les sorties axonales du vHPC acheminent préférentiellement les caractéristiques indépendantes d'un comportement donné7.

Ici, nous avons montré que le vHPC traite les expériences appétitives et aversives dans des populations définies de cellules qui sont partiellement distinctes aux niveaux moléculaire, cellulaire et spécifique à la projection. Nous avons également démontré leur capacité à piloter des comportements à travers des terminaux fonctionnellement plastiques spécifiques à la projection. Nos données immunohistochimiques suggèrent que vCA1 contient au moins trois populations de neurones : deux sous-ensembles qui peuvent être délimités en fonction de leurs localisations antéro-postérieures et de leur réponse préférentielle aux valences appétitives ou aversives, et une troisième population qui répond aux deux, reflétant peut-être une prédilection biologique pour saillance5. Bien que leurs sorties structurelles et fonctionnelles exactes à l'échelle du cerveau restent indéterminées, nous supposons que notre population observée de cellules vCA1 répondant à l'aversion est un sur-ensemble de cellules d'anxiété récemment observées qui transmettent des informations à l'hypothalamus25 et au PFC38. De plus, les cellules vCA1 traitant des informations aversives ou appétitives acheminent peut-être les informations vers et innervent le BLA et le NAc à différents types anatomiques, récepteurs et cellulaires, optimisant spécifiquement leur capacité à intégrer des informations mnémoniques25.

De plus, en combinant des stratégies de marquage transgéniques dépendantes de l'activité avec l'expression de fluorophores basée sur tous les virus, notre conception permet la visualisation de plusieurs ensembles d'une manière intra-sujet, ce qui rejoint les études précédentes surveillant et manipulant un seul ensemble actif à deux niveaux discrets. points de temps ainsi26. En croisant ces approches avec des stratégies de séquençage génétique, ces outils permettent le marquage, la manipulation et la documentation moléculaire des cellules traitant les comportements aversifs et appétitifs, ouvrant la possibilité de cataloguer les similitudes et les différences topographiques entre les deux à l'échelle du cerveau. Par exemple, de futures études pourraient sonder la composition moléculaire des cellules vCA1 étiquetées appétitives et aversives le long de son axe antéro-postérieur, et tester si oui ou non les profils transcriptomiques de ces cellules diffèrent à la fois selon la valence et leur emplacement physique. De plus, il est intrigant que les terminaux vCA1 étiquetés appétitifs et aversifs aient montré des signes de ségrégation dans l'amygdale et l'hippocampe. Par conséquent, des recherches ultérieures peuvent chercher à démêler fonctionnellement leurs contributions au comportement et à mesurer les types d'informations qu'ils transmettent grâce à une combinaison d'approches d'imagerie et de perturbation spécifiques au terminal.

Il est important de limiter les interprétations des engrammes compte tenu de la vaste gamme d'outils génétiques utilisés pour accéder aux cellules d'une manière dépendante de l'activité. Par exemple, les ensembles vCA1 varient considérablement en taille et en modèles d'activité à travers l'apprentissage et la mémoire. Ces nombres varient de pourcentages simples et peuvent atteindre ~ 35 % des cellules en fonction du marqueur de gène précoce immédiat utilisé, de la stratégie de marquage, de la lignée de rongeurs et des outils viraux utilisés36,39,40,41. À juste titre, nous pensons que notre stratégie de double marquage suréchantillonne en partie le nombre de cellules marquées compte tenu du délai nécessaire pour que le marquage se produise (par exemple, 48 heures hors Dox ; 72 heures après l'injection de 4OHT42,43,44,45), et les expériences futures pourraient viser à améliorer la résolution temporelle des approches de marquage contemporaines afin d'améliorer le rapport signal sur bruit du marquage lié à l'expérience au marquage de fond ou à la fuite. De plus, les cellules cFos + ne reflètent qu'un sous-ensemble d'un engramme qui est autrement distribué dans tout le cerveau et recrute de nombreux gènes précoces immédiats, types de cellules et activité physiologique complémentaire que les marqueurs dépendant de l'activité peuvent ne pas capturer en raison des échelles de temps relativement lentes de l'expression génique . Nous notons en effet que si les cellules cFos + indiquent une activité neuronale récente, une cellule récemment active ne doit pas nécessairement exprimer cFos, en particulier dans les régions du cerveau et les types de cellules qui ont vraisemblablement leurs propres seuils d'expression de cFos. Ces points mettent en évidence la nature complexe d'un engramme de mémoire et soulignent une prudence qui est justifiée lors de l'interprétation des données à la lumière des limitations techniques inhérentes. Nous pensons qu'une approche à multiples facettes combinant des stratégies de marquage génétique avec une imagerie en temps réel lors de comportements complexes aidera à démêler la relation entre l'activité neuronale, les modifications génétiques et les changements au niveau du système en réponse à l'apprentissage et à la mémoire.

Nos manipulations terminales sont conformes aux études récentes démontrant le routage spécifique au terminal des informations des corps cellulaires vCA1 à travers une variété de processus simples, bi- et trifurcatifs8,46,47. Nos données fournissent une démonstration de gain de fonction selon laquelle les terminaux vCA1 activés peuvent entraîner la préférence ou l'aversion, ce qui, selon nous, a été obscurci par la stimulation du corps cellulaire étant donné que cette dernière active vraisemblablement le corps cellulaire et la plupart, sinon la totalité, des sorties axonales correspondantes. Le premier modulerait sélectivement un ensemble de terminaux émergeant de vCA1 qui se projettent vers une zone cible distincte tout en n'affectant que de manière minimale les terminaux vCA1 se projetant vers d'autres zones cibles. De plus, alors que la base moléculaire sous-jacente à nos expériences de commutation de valence reste inconnue, nous postulons que la plasticité du transcriptome pourrait conférer la capacité de changer l'aspect du comportement qu'un terminal conduit étant donné les réponses rapides et durables à l'apprentissage et à la mémoire présentes au niveau génétique. niveau dans les cellules étiquetées34.

En effet, le paysage transcriptionnel complet dans l'hippocampe de la souris est dynamique tout au long de la durée de vie de la formation et du rappel de la mémoire, et ses modifications dépendantes de l'expérience sont largement présentes spécifiquement dans les cellules étiquetées quelques minutes après l'apprentissage et durent plusieurs semaines47. De futures expériences pourraient effectuer un séquençage d'ARN sur des cellules avant et après le protocole d'induction pour mesurer les changements transcriptionnels qui en résultent et identifier les loci putatifs médiant une telle plasticité fonctionnelle. De plus, nos données de séquençage améliorent notre compréhension de la façon dont l'hippocampe ventral analyse génétiquement les engrammes appétitifs et aversifs, comment ces expériences peuvent provoquer un changement dans la régulation à la hausse et à la baisse de gènes discrets, et comment ces expériences peuvent avoir des effets durables sur le génome épigénétique par l'étude de la méthylation (Fig. 4). Les études futures, par exemple, peuvent s'appuyer sur des travaux récents évaluant la connectivité moléculaire et définie par projection entre vCA1 et ses cibles en aval avec MAPSeq1, tout en ajoutant un composant dépendant de l'activité, comme notre approche de marquage à double mémoire, pour mesurer les principes d'organisation de la l'hippocampe ventral et ses projections d'une manière qui tient compte de l'histoire d'une cellule. Cette étude fournit en particulier une plate-forme influente pour caractériser l'organisation de l'hippocampe ventral et ses modèles d'entrée-sortie non aléatoires, et nous postulons que cette logique comprend une dimension définie en fonction de l'activité, de sorte que les expériences appétitives et aversives engagent un hippocampe d'entrée-sortie unique. les circuits aussi.

Enfin, alors que la base physiologique par laquelle les terminaux peuvent changer ou réinitialiser leur capacité à conduire des comportements spécifiques à la valence reste incertaine, des études futures pourraient envisager des mécanismes candidats, notamment la plasticité homéostatique, la croissance et la rétraction dendritiques, et les changements facilités par le contre-conditionnement le long de l'axone. interface de dendrite entre vCA1 et le BLA ou NAc24,37. Conformément à cette spéculation, des études antérieures ont démontré que l'hippocampe dorsal contient des ensembles définis de corps cellulaires fonctionnellement plastiques suffisants pour conduire un comportement aversif ou appétitif, tandis que le BLA contient des populations fixes qui sont suffisantes pour conduire chaque comportement en fonction de l'emplacement anatomique stimulé le long. l'axe antéro-postérieur ainsi que sur leurs sites spécifiques de projection7,8,24,25,37. Des recherches ultérieures peuvent viser à utiliser notre approche de marquage à double mémoire pour cartographier génétiquement et physiologiquement les types de cellules et les circuits qui présentent également de telles réponses câblées ou dépendantes de l'expérience aux souvenirs émotionnels. Dans notre étude, nous supposons que les cellules vCA1 deviennent appétitives ou aversives d'une manière dépendante de l'expérience au lieu d'être câblées pour l'une ou l'autre valence en soi, comme cela a été observé dans de nombreuses autres régions du cerveau (par exemple BLA24). Cependant, bien qu'il reste possible qu'un sous-ensemble de ces cellules vCA1 soit préférentiellement réglé pour traiter une valence donnée d'une manière indépendante de l'expérience. En effet, l'idée que l'expérience elle-même modifie ces neurones pour qu'ils deviennent appétitifs ou aversifs n'exclut pas la possibilité que des expériences ultérieures modifient leur capacité de manière flexible à conduire un comportement donné associé à une valence donnée.

De plus, dans notre étude, alors que les critères de valence étaient remplis à la Fig. 1 (par exemple, les cellules de l'hippocampe répondaient différemment aux stimuli de valence positive et négative d'une manière indépendante des caractéristiques du stimulus), nos ensembles de données ultérieurs se sont concentrés sur un seul appétit ( par exemple les interactions sociales homme-femme) et une seule expérience aversive (par exemple, les chocs au pied) pour un profilage moléculaire, anatomique et comportemental approfondi. Surtout, nous soulignons ici que pour faire une déclaration directe sur la valence, la structure de la tâche doit être maintenue constante. Par exemple, une interprétation alternative de nos données actuelles est que nos différences observées dans les profils d'enrichissement génétique et la ségrégation anatomique sont dues aux différences inhérentes aux tâches utilisées (par exemple, les interactions sociales homme-femme par rapport au conditionnement contextuel de la peur), et non à la valence en soi. . Il reste donc possible que les interactions sociales homme-femme, qui nécessitent une intégration multimodale d'indices sociaux et contextuels, recrutent un ensemble unique de gènes et d'anatomie ventrale de l'hippocampe par rapport au conditionnement contextuel de la peur, dans lequel un indice conditionné (par exemple, le contexte) est associée à un signal inconditionnel (par exemple un choc), et recrute donc une activité moléculaire et anatomique spécifique à la tâche. En tant que tel, nous proposons que les études futures puissent se concentrer sur les expériences de marquage dans lesquelles la plupart, sinon la totalité, des caractéristiques environnementales sont maintenues constantes, à l'exception de la valence associée à un stimulus unimodal lui-même, qui, selon nous, ouvre une plate-forme expérimentale pour étudier comment de multiples expériences de des valences similaires ou variables engagent différentiellement des populations cellulaires. Bien que nous pensions que cela s'expliquait en partie par l'utilisation de plusieurs expériences de valence similaire sur la figure 1, des expériences futures supplémentaires pourraient mettre en œuvre une approche d'enregistrement in vivo dans laquelle des cellules supposées marquées négatives et positives sont imagées tandis que la structure et la valence des tâches varient de manière paramétrique. . S'appuyant sur cette notion, nos données de méthylation de l'ARN-Seq et de l'ADN fournissent un moyen supplémentaire par lequel les souvenirs modifient les fonctions du génome de manière dépendante de la valence, à la fois dans des états sains et pathologiques. Par exemple, nos données de méthylation ont identifié Pin148,49 parmi 266 DMG dans les cellules vCA1 appétitives, qui est connue pour ses qualités neuroprotectrices spécifiquement dans la neurodégénérescence par la régulation de la propagation de cis p-tau. Des études de suivi peuvent tirer parti de ces engrammes appétitifs en modifiant ces DMG comme moyen de soulager les maladies psychiatriques et neurodégénératives.

Ensemble, nous proposons qu'en plus de traiter des unités d'information spatio-temporelles, l'hippocampe contient des ensembles discrets de cellules traitant des informations aversives et appétitives qui relaient des informations spécifiques au contenu et pertinentes sur le plan comportemental vers les zones en aval dans un contexte moléculaire défini et spécifique à la projection. manière, fournissant ainsi collectivement un substrat biologique multisynaptique pour plusieurs engrammes de mémoire.

Des souris FosCreER (jax stock : #021882) et Wildtype mâles C57BL/6 (âgées de 2 à 3 mois ; Charles River Labs) ont été logées en groupes de 5 souris par cage. Le vivarium animal a été maintenu sur un cycle de lumière de 12:12 heures (lumières allumées à 0700). Les souris ont été placées sous un régime contenant 40 mg/kg de doxycycline (Dox) pendant au moins 48 heures avant la chirurgie avec accès à la nourriture (régime à la doxycycline) et à l'eau ad libitum. Les souris ont eu un minimum de dix jours après la chirurgie pour récupérer. Le régime contenant de la dox a été remplacé par de la nourriture standard pour souris (ad libitum) 48 heures avant le marquage comportemental pour ouvrir une fenêtre temporelle de marquage dépendant de l'activité1,2. Tous les sujets ont été traités conformément au protocole 17-008 approuvé par l'Institutional Animal Care and Use Committee de l'Université de Boston. Les expériences étaient toutes conformes à toutes les réglementations éthiques applicables aux tests et à la recherche sur les animaux, telles que dictées par les normes de l'AALAC et de l'IACUC.

Les injections stéréotaxiques et les implants de fibres optiques suivent les méthodes rapportées précédemment1,2. Toutes les chirurgies ont été réalisées sous guidage stéréotaxique et les coordonnées ultérieures sont données par rapport au bregma (en mm). Les injections dorso-ventrales ont été calculées et mises à zéro par rapport au crâne. Les souris ont été placées dans un cadre stéréotaxique (Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA) et anesthésiées avec 3% d'isoflurane pendant l'induction et abaissées à 1-2% pour maintenir l'anesthésie (oxygène L/min) tout au long de la chirurgie. Une pommade ophtalmique a été appliquée sur les deux yeux pour prévenir la dessiccation cornéenne. Les poils ont été épilés avec une crème dépilatoire et le site chirurgical a été nettoyé trois fois avec de l'éthanol et de la bétadine. Suite à cela, une incision a été faite pour exposer le crâne. Les craniotomies bilatérales impliquaient de percer des fenêtres à travers le crâne au-dessus des sites d'injection à l'aide d'un foret de 0,5 mm de diamètre. Les coordonnées étaient -3,16 antéropostérieur (AP), ± 3,1 médiolatéral (ML) et -4,6 dorsoventral (DV) pour vCA1 ; −1,8 AP, ± 3,1 ML et −4,7 DV pour le BLA ; −1,25 AP, ± 1,0 ML et −4,7 DV pour le NAc ; 1,70 AP, ± 0,35 ML et -2,8 DV pour le PFC. Toutes les souris ont reçu une injection d'un volume de 300 nl de cocktail par site à un taux de contrôle de 100 μl min-1 à l'aide d'une aiguille biseautée de calibre 33 remplie d'huile minérale fixée à une microseringue Hamilton de 10 μl (701LT; Hamilton) dans une microseringue pompe (UMP3; WPI). L'aiguille est restée au site cible pendant cinq minutes après l'injection avant d'être retirée. Pour toutes les cibles, des fibres optiques bilatérales ont été placées à 0,5 DV au-dessus du site d'injection. Des vis de bijoux fixées au crâne servaient d'ancres. Des couches de ciment adhésif (C&B Metabond) suivies de ciment dentaire (AM Systems) ont été étalées sur le site chirurgical. Les souris ont reçu 0,1 ml de buprénorphine à 0,3 mg/ml (par voie intrapéritonéale) après la chirurgie et ont été placées sur un coussin chauffant pendant la chirurgie et la récupération. L'évaluation histologique a vérifié le ciblage viral et les placements de fibres. Les données des injections hors cible n'ont pas été incluses dans les analyses.

pAAV9-cFos-tTA, pAAV9-TRE-eYFP et pAAV9-TRE-mCherry ont été construits comme décrit précédemment (Ramirez et al., 2015). L'AAV9-c-Fos-tTA a été combiné avec l'AAV9-TRE-eYFP ou l'AAV9-TRE-ChR2-EYFP (noyau du vecteur UMass) avant l'injection dans un rapport de 1:1. Ce cocktail a ensuite été combiné dans un rapport 1: 1 AAV9-CAG-Flex-DIO-TdTomato (UNC Vector Core).

Les implants de fibres optiques ont été branchés sur un cordon de brassage connecté à une diode laser de 450 nm contrôlée par un logiciel automatisé (Doric Lenses). La sortie laser a été testée au début de chaque expérience pour s'assurer qu'au moins 15 mW de puissance étaient délivrés à l'extrémité du cordon de raccordement (lentilles doriques).

Lorsque les animaux étaient hors Dox, comme indiqué précédemment9, 10, 11, 12, le régime Dox a été remplacé par une nourriture de laboratoire standard (ad libitum) 48 heures avant le marquage comportemental. Exposition des femelles : Une souris femelle (PD 30–40) a été placée dans une cage domestique propre avec un dessus de cage transparent. La souris mâle expérimentale a ensuite été placée dans la chambre et laissée interagir librement pendant 2 heures. Exposition à la peur : les souris ont été placées dans une chambre de conditionnement et ont reçu quatre chocs de pied de 1,50 mA (2 s) au cours d'une séance d'entraînement de 8 minutes. Après le marquage, Dox a été réintroduit dans le régime alimentaire et les souris mâles ont été renvoyées dans leur cage d'origine avec accès au régime Dox. Pour le marquage 4-OHT, le 4-hydroxytamoxifène (Sigma : H7904) a été dilué dans de l'éthanol à 100 % et vortexé pendant 5 minutes. Une fois en solution, de l'huile de maïs a été ajoutée et la solution a été soniquée pour obtenir une dilution de 10 mg/kg de stock. Lorsque la solution était prête, le 4-OHT a été chargé dans des seringues pour injection et toute solution restante a été placée à -20 ° C pour être utilisée à l'avenir. Le jour du marquage, 200 mg d'un stock de 10 mg/ml (2 mg de 4OHT) ont été administrés IP à des souris FoscreER 30 minutes après le comportement et ont été laissés au repos pendant 72 heures. Les souris ont reçu une injection de solution saline ou de DMSO au moins deux fois avant le protocole de marquage pour acclimater les animaux à l'injection et empêcher le marquage hors cible.

Tous les tests de comportement ont été effectués pendant le cycle de lumière de la journée (0700-1900). Les souris ont été manipulées pendant 3 à 5 jours, 5 à 10 minutes par jour, avant toutes les expériences comportementales. La chambre de test consistait en une boîte rectangulaire construite sur mesure avec un support de fibre optique (38 × 23,5 × 42 cm). La bureaucratie a divisé la chambre au milieu, créant deux moitiés. Les côtés droit et gauche pour la stimulation ont été randomisés. Le jour 1 a été utilisé pour évaluer les niveaux de base, au cours desquels la souris a eu 10 minutes pour explorer librement l'arène. Les animaux ont été réexécutés dans les jours de référence s'ils montraient une préférence de plus de 45 à 55 % pour l'un ou l'autre côté. Les animaux ont été acclimatés à la chambre jusqu'à ce qu'ils aient une préférence minimale de 45/55. Une fois la ligne de base atteinte, le jour suivant la première étiquette engramme, les souris ont reçu une stimulation lumineuse (impulsions de 15 ms à 20 Hz) lors de leur entrée dans le côté désigné de la chambre (contrebalancé entre les groupes) sur une période de test de 10 minutes. Une fois que la souris est entrée dans le côté stimulé, un signal TTL du logiciel EthoVision via une boîte USB-IO Noldus a déclenché un générateur de stimulus (STG-4008, systèmes multicanaux). 6 Une caméra vidéo (Activeon CX LCD Action Camera) a enregistré chaque session et un expérimentateur aveugle aux conditions de traitement a noté la durée de chaque côté. Les analyses statistiques impliquaient des ANOVA unidirectionnelles comparant les scores de différence de groupe [temps (en secondes) sur le côté stimulé moins le temps sur le côté non stimulé] ainsi que les changements au fil des jours à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle appariée ou à mesures répétées. Les diagrammes comportementaux ont été réalisés avec BioRender.

Pour l'induction optogénétique de la peur, les sujets ont été placés dans une chambre de choc avec une stimulation lumineuse (20 Hz, 15 ms) pendant 500 secondes. Des chocs au pied (1,5 mA, durée de 2 s) ont été administrés aux points temporels de 198 s, 278 s, 358 s et 438 s. Au cours de l'induction de récompense optogénétique, dans une pièce différente de l'étiquette de peur initiale, le sujet a été placé dans une cage à domicile propre avec une souris femelle. Une stimulation lumineuse (20 Hz, 15 ms) a été appliquée à la souris mâle pendant 10 minutes.

L'immunohistochimie suit les protocoles précédemment rapportés15,16,18. Les souris ont été surdosées avec 3 % d'isoflurane et perfusées par voie transcardiaque avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) froide (4 °C), suivie de 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS. Les cerveaux ont été extraits et stockés pendant une nuit dans du PFA à 4 ° C. Des sections coronales de cinquante μm ont été prélevées en série à l'aide d'un vibratome et recueillies dans du PBS froid. Les coupes ont été bloquées pendant 1 heure à température ambiante dans du PBST et 5 % de sérum de chèvre normal (NGS) ou de sérum d'albumine bovine (BSA) sur un agitateur. Les coupes ont été transférées dans des puits contenant des anticorps primaires (1:1000 guinée anti-c-Fos [SySy]; 1:1000 lapin anti-RFP [Rockland]; 1:5000 poulet anti-GFP [Invitrogen]) et incubées sur un shaker pendant une nuit à température ambiante ou 3 jours à 4 degrés C. Les coupes ont ensuite été lavées dans du PBST pendant 10 minutes (x3), suivies d'une incubation de 2 heures avec un anticorps secondaire (1:200 Alexa 555 anti-lapin [Invitrogen] ; 1 :200 Alexa anti-guinée 647 [Invitrogen] ; 1:200 Alexa 488 anti-poulet [Invitrogen]). Après trois lavages supplémentaires de 10 minutes dans du PBST, les coupes ont été montées sur des microlames (VWR International, LLC). Le milieu de montage Vectashield Hart Set avec DAPI (Vector Laboratories, Inc) a été appliqué, les lames ont été couvertes et laissées sécher pendant la nuit.

Seuls les animaux qui avaient des injections bilatérales précises ont été sélectionnés pour la quantification. Les images fluorescentes ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal (Zeiss LSM800, Allemagne) à l'objectif 20X. Pour la quantification des cfos, tous les animaux ont été sacrifiés 90 minutes après le comportement pour des analyses immunohistochimiques. Le nombre de neurones EYFP, TdTomato et c-Fos-immunoréactifs dans le vCA1 a été compté pour mesurer le nombre de cellules actives dans la zone respective. 3 à 5 coupes coronales (espacées de 50 µm les unes des autres) par souris dont les moyennes ont été prises ; chaque valeur N contient 3-5 quantification d'image pour 3-5 souris. Le nombre de cellules eYFP-positives, TdTomato-positives, c-Fos-positives et DAPI-positives dans une région d'intérêt (ROI) définie a été quantifié manuellement sur deux expérimentateurs différents avec ImageJ (https://imagej.nih. gov/ij/). La taille du retour sur investissement a été standardisée entre les cerveaux, les animaux, les expériences et les groupes. Les deux compteurs étaient aveugles aux groupes expérimentaux et témoins. Pour calculer le pourcentage de cellules étiquetées, nous avons compté le nombre de cellules fluorescentes positives et les avons divisées par le nombre total de cellules DAPI. Les chevauchements ont également été comptés en pourcentage sur DAPI, par exemple, les cellules positives pour EYFP et TdTomato ont été comptées sur DAPI. Les diagrammes du diagramme de Venn sont des graphiques représentatifs de la proportion de cellules EYFP + , TdTomato + et cfos + normalisées à 100 % et non au DAPI.

Des coupes coronales de 50 microns ont été colorées avec du poulet anti GFP (1:1000) et du lapin anti RFP (1:1000) comme décrit ci-dessus. Les images fluorescentes ont été prises à un grossissement de 20X à l'aide d'un microscope confocal (Zeiss LSM800, Allemagne). Tous les paramètres de laser et d'imagerie ont été maintenus cohérents pour tous les animaux et toutes les régions du cerveau imagés. Les régions d'intérêt (ROI) ont été maintenues cohérentes entre les images, les sections et les animaux. Les retours sur investissement ont été identifiés à l'aide de points de repère et en faisant référence au Paxinos & Franklin Mouse Brain Atlas. La quantification de la fluorescence a été réalisée dans ImageJ. Après la sélection manuelle du retour sur investissement à l'aide de l'outil de sélection, nous nous sommes mis à collecter des informations sur la densité intégrée de la zone et la valeur de gris moyenne. Les images ont été analysées séparément pour EYFP et TdTomato. Dans chaque image, nous avons recueilli des informations sur la fluorescence moyenne des terminaux ainsi que sur les niveaux de fond/de base d'une région négative pour avoir un moyen de normalisation. À partir de là, nous avons utilisé la formule suivante pour Corrigé

Fluorescence totale (CTF)50,51,52

Cela nous a donné les unités arbitraires pour l'intensité de fluorescence moyenne de nos terminaux EYFP vs TdTomato d'intérêt.

Les fichiers image acquis (.czi) ont été ouverts dans ImageJ. Le traitement des images de la Fig. 1 impliquait de maximiser l'intensité, de supprimer le bruit aberrant et d'ajuster le contraste des images.

Des souris mâles âgées de cinq semaines marquées avec le transgène 1 ChR2-YFP après conditionnement ont été euthanasiées à l'isoflurane. Des cerveaux de souris ont été rapidement extraits et les régions hippocampiques ont été isolées par microdissection. Huit souris ont été regroupées par chaque condition expérimentale. Une suspension de cellule unique a été préparée conformément aux directives du kit de dissociation du cerveau adulte (Miltenyi Botec, n° de catalogue : 13-107-677). En bref, les échantillons d'hippocampe ont été incubés avec des enzymes de digestion dans le tube C placé sur le gentleMACS Octo Dissociator with Heaters avec le programme gentleMACS : 37C_ABDK_01. Après la fin du programme, les échantillons ont été appliqués à travers un MACS SmartStrainer (70 μm). Ensuite, une étape d'élimination des débris et une étape d'élimination des globules rouges ont été appliquées pour obtenir une suspension de cellule unique.

La suspension cellulaire unique a été soumise à un trieur de cellules BD FACSAria selon le protocole du fabricant pour isoler la population de cellules uniques EYFP.

L'ARN des cellules YFP-positives isolées par FACS a été extrait à l'aide de Trizol (Life Technologies) suivi du kit Direct-zol (Zymo Research) conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, la bibliothèque RNA-seq a été préparée à l'aide du kit d'ARN à faible entrée SMART-Seq® v4 Ultra® (TaKaRa).

Les lectures résultantes d'Illumina étaient de bonne qualité en vérifiant avec FastQC53. Les 40 premières paires de bases des lectures ont été cartographiées sur le génome de la souris (mm10) à l'aide de STAR26, qui a été indexé avec l'annotation du gène Ensembl GRCm38.91. Le nombre de lectures a été obtenu à l'aide de la fonction featureCounts54 du package Subread avec l'option55 non bloquée. Les lectures ont été normalisées par la taille de la bibliothèque et l'analyse de l'expression différentielle basée sur la distribution binomiale négative a été effectuée avec DESeq256. Les gènes avec une valeur de p ajustée au FDR inférieure à 0, 00001 plus une différence de plus de 4 fois ont été considérés comme exprimés de manière différentielle. Les données brutes ainsi que les niveaux d'expression des gènes sont déposés dans NCBI Gene Expression Omnibusas GSE198731. Pour l'analyse Gene Ontology, nous avons classé les gènes codant pour les protéines en fonction de leurs changements de pli et les avons utilisés comme données d'entrée pour l'outil GseaPreranked57. Sur la base des sorties GSEA, les tracés de points ont été créés avec un script R personnalisé. Les voies avec une valeur de p ajustée au FDR inférieure à 0,25 ont été considérées comme enrichies. Le réseau GeneMANIA a été analysé par GeneMANIA33. Les gènes résultants maximum étaient de 20 et les attributs résultants maximum étaient de 10. Tous les réseaux ont reçu un poids égal. Les tracés du réseau ont été générés par Cytoscape58.

L'ADN génomique des cellules YFP-positives isolées par FACS a été extrait à l'aide du kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, l'ADN génomique a été digéré par l'enzyme MspI (NEB) et la taille sélectionnée à l'aide du kit de sélection de taille d'ADN EpiNext™ (EpigenTek) pour enrichir le fragment d'ADN entre 100 et 600 pb. Les fragments d'ADN sélectionnés ont été utilisés pour être préparés dans une bibliothèque de séquençage avec le kit EpiNext™ High-Sensitivity Bisulfite-Seq (EpigenTek) conformément aux instructions du fabricant.

Les lectures brutes ont été coupées à l'aide de cutadapt59, puis cartographiées sur le génome de la souris (mm10) à l'aide du module Bismark60 Mcomp de MOABS61 a été utilisé pour appeler les cytosines (DMC) et les régions (DMR) méthylées différemment. Seules les cytosines couvertes d'au moins cinq lectures ont été utilisées pour une analyse plus approfondie. Les différences dans les niveaux de méthylation de l'ADN supérieures à 0,2 et la valeur P du test exact de Fisher inférieure à 0,05 ont été considérées comme des DMC. Les données brutes sont déposées auprès du NCBI Gene Expression Omnibus sous le nom GSE208137. Les régions méthylées différemment comprenaient au moins deux DMC, et la distance maximale entre deux DMC était de 300 pb. Le logiciel Homer62 a été utilisé pour l'annotation des DMC et des DMR. L'analyse GO a été effectuée par le package R clusterProfiler63.

Des souris mâles FosCRE-ERT2 ont reçu une injection d'un rapport 1: 1 d'AAV-CAG-FLEX-TdTomato + AAV-cfos-tTA + AAv-TRE-EYFP dans l'hippocampe ventral. Les animaux ont été contrebalancés pour l'expérience où la moitié a reçu un marquage appétitif avec 4OHT et un marquage aversif avec Dox et l'autre moitié a reçu un marquage aversif avec 4OHT et un marquage appétitif avec Dox. Des tranches coronales de l'hippocampe ventral ont été préparées à partir d'animaux préalablement injectés, 3 à 5 jours après l'expérience de marquage. Les animaux ont été profondément anesthésiés avec une anesthésie à l'isoflurane, décapités et les cerveaux ont été prélevés. Des tranches de cerveau ont été préparées dans du liquide céphalo-rachidien artificiel de substitution de saccharose (ACSF) perfusé d'oxygène. Solution contenue : NaCl 185 mM, KCl 2,5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, MgCl2 mM, NaHCO3 25 mM, glucose 12,5 mM et CaCl2 0,5 mM. Des tranches de 400 µm ont été coupées via Leica VT 1200 (Leica Microsystems) et incubées dans 30 ° C ACSF composé de 125 mM de NaCl, 25 mM de NaHCO3, 25 mM de D-glucose, 2 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1,25 mM de NaH2PO4 et 1 mM MgCl2, pendant 20 minutes puis refroidi à température ambiante. Un système d'imagerie à deux photons (Thorlabs Inc.) a été utilisé pour distinguer les cellules appétitives et aversives. Le système d'imagerie est équipé d'un laser Ti:Sapphire à verrouillage de mode (Chameleon Ultra II; Coherent) qui a été réglé sur des longueurs d'onde comprises entre 920 nm et 950 nm afin d'exciter les fluorophores Alexa Fluor 488 et 568, tdTomato et EYFP à l'aide d'un 20x, NA Objectif 1.0 (Olympus). Afin de s'assurer que les différences entre les deux populations ne sont pas attribuables au type de virus utilisé pour le marquage des neurones, deux groupes d'animaux ont été préparés. Dans un groupe, les souvenirs appétitifs étiquetés avec tdTomato et ceux aversifs avec EYFP et dans l'autre vice versa. Des électrodes patch-clamp avec des pointes de 0, 6 à 1 μm ont été tirées via un extracteur horizontal (Sutter Instruments) et la résistance de la pipette a été enregistrée entre 4 et 6 MΩ. Les pipettes ont été remplies de liquide intracellulaire contenant : 120 mM de K-gluconate, 20 mM de KCl, 10 mM d'HEPES, 7 mM de diTrisPhCr, 4 mM de Na2ATP, 2 mM de MgCl2, 0,3 mM de Tris-GTP et 0,2 mM d'EGTA ; tamponné à pH 7,3 avec KOH. 0,15 % poids/volume d'hydrazide Alexa Fluor (Thermo Fisher Scientific) 488 (pour l'enregistrement à partir de cellules tdTomato) ou 567 (pour l'enregistrement à partir de cellules EYFP) ont été ajoutés pour visualiser la pipette d'enregistrement sous le système d'imagerie. Avant de pénétrer dans les cellules, la neutralisation de la capacité de la pipette et la compensation de l'équilibre du pont ont été effectuées. Les données ont été acquises à l'aide d'un Multiclamp 700B (Molecular Devices) et d'un Digidata 1550 (Molecular Devices) avec une fréquence d'échantillonnage de 10 kHz.

L'analyse des données d'électrophysiologie des tranches de cerveau a été réalisée en python avec des scripts personnalisés à l'aide du package pyABF (http://swharden.com/pyabf/). Pour l'analyse de la forme des pointes, les apparitions des pointes ont été identifiées à l'aide de leur première dérivée, la tension correspondante a été appelée apparition des pointes. La demi-largeur du pic indique le temps entre les deux moitiés de la tension de crête. Pour l'analyse dynamique des propriétés de pointe, des injections de courant par étapes ont été effectuées. Le seuil de déclenchement est la tension à laquelle un neurone déclenche au moins une seule pointe, et le début de déclenchement est le courant correspondant. Le gain FI a été calculé comme la variation de la fréquence d'amorçage de la fréquence d'amorçage la plus basse à la plus élevée divisée par le courant injecté. Le rapport d'adaptation a été obtenu en divisant les intervalles moyens entre les pics (ISI) au cours des 200 dernières ms de dopage par les ISI moyens au cours des 200 premières ms de dopage. La comparaison entre les cellules de mémoire appétitives et aversives a été effectuée à la fois au sein d'une seule tranche, au sein d'un animal ainsi qu'entre les animaux pour contrôler les différences potentielles entre les animaux ou les tranches. Étant donné que les résultats dans les trois situations étaient similaires, les données regroupées pour la comparaison des différents groupes de test d'Agostino-Pearson K2 ont été utilisées pour déterminer la normalité des données. Sur la base des résultats de normalité, un test t indépendant (distribution normale) ou un test de Mann-Whitney-Wilcoxon bilatéral avec correction de Bonferroni a été utilisé.

Les sujets ont été assignés au hasard à des groupes. Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour déterminer la taille de l'échantillon; le nombre de sujets par groupe était basé sur ceux des études précédemment publiées et est rapporté dans les légendes des figures.

Les expériences comportementales ont été reproduites au moins trois fois avec trois expérimentateurs différents. Les premières expériences ont été menées dans une institution différente et les deux dernières répétitions ont été menées à l'Université de Boston. Non seulement les résultats comportementaux étaient valables pour tous les expérimentateurs (1 homme, 2 femmes), mais ils étaient également valables pour toutes les institutions. Les données de séquençage ont également été reproduites deux fois pour confirmer les résultats originaux. Tous les compteurs et marqueurs comportementaux et cellulaires ont été aveuglés aux groupes expérimentaux et témoins.

Pour les expériences comportementales ont été menées sur une taille d'échantillon allant de 7 à 10 ; les animaux mal ciblés ou présentant une expression unilatérale du virus ont été retirés de l'expérience. Pour l'analyse histologique, la taille des échantillons variait de 3 à 4 animaux avant le groupe. Les données de séquençage d'ARN ou de RRBS ont été réalisées avec un groupe d'échantillons regroupés de 8 animaux par groupe expérimental. Témoin simulé ou non étiqueté, la taille de l'échantillon était de 2 souris. Pour les expériences d'électrophysiologie, la taille de l'échantillon variait de 4 à 8 animaux. Les données ont été analysées à l'aide de Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). Les données ont été analysées à l'aide de tests t appariés (deux facteurs), de tests t non appariés, d'ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle avec des ANOVA à mesures répétées (plus de deux facteurs), le cas échéant. Des analyses post-hoc (test de comparaisons multiples de Tukey) ont été utilisées pour caractériser les effets du traitement et de l'interaction, lorsque l'alpha statistiquement significatif était défini à p < 0,05, bilatéral). Les analyses statistiques sont rapportées dans les légendes des figures. Tous les graphiques avec des graphiques à barres affichés représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données de séquençage d'ARN et de méthylation sont accessibles au public via la plateforme NIH, Gene Expression Omnibus (GEO) available RNA-seq data : GSE198731 and RRBS-seq data : GSE208137 respectivement. Les données comportementales sont disponibles sur demande des auteurs principaux. Les données sources sous-jacentes aux Figs. 1, 2, 3 et 6 se trouvent dans les données supplémentaires 2. Des données supplémentaires qui appuient les conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions le Dr Joshua Sanes et son laboratoire du Center for Brain Science de l'Université de Harvard, pour avoir fourni un espace de laboratoire dans lequel les premières expériences ont été menées, en particulier les premiers membres du laboratoire, Emily Merfeld, Emily Doucette, Stephanie Grella et Joseph Zaki. De plus, nous remercions le noyau du Center for Brain Science Neuroengineering pour son soutien technique, et la Society of Fellows de l'Université de Harvard pour son soutien. Ce travail a été soutenu par un NIH Early Independence Award (DP5 OD023106-01), un NIH Transformative R01 Award, une Young Investigator Grant de la Brain and Behavior Research Foundation, une bourse de la Ludwig Family Foundation, le McKnight Foundation Memory and Cognitive Disorders award, le Center for Systems Neuroscience and Neurophotonics Center de l'Université de Boston, et un package de démarrage de l'Université de Columbia (UR011118).

Programme d'études supérieures en neurosciences, Université de Boston, Boston, 02215, MA, États-Unis

Monika Shpokayte

Département des sciences psychologiques et cérébrales, The Center for Systems Neuroscience, Université de Boston, Boston, 02215, MA, États-Unis

Monika Shpokayte, Evan Ruesch et Steve Ramirez

Programme d'études supérieures en neurosciences, Brown University, Providence, 02912, RI, États-Unis

Olivia McKissick

Département de physiologie et de biophysique cellulaire, Columbia University Medical Center, New York, 10032, NY, États-Unis

Xiaonan Guan & X. Shawn Liu

Institut Whitehead pour la recherche biomédicale, MIT, Cambridge, 02142, MA, États-Unis

Bingbing Yuan

Département de génie biomédical, Université de Boston, Boston, 02215, MA, États-Unis

Bahar Rahsepar, Fernando R. Fernandez, John A. White et Steve Ramirez

Neurophotonics Center et Photonics Center, Université de Boston, Boston, 02215, MA, États-Unis

Bahar Rahsepar, Fernando R. Fernandez et John A. White

Université Loyola, Département de psychologie de Chicago, Chicago, Illinois, 60660, États-Unis

Stéphanie L. Grella

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MS et OM ont réalisé et analysé l'histologie. MS, OM et ER ont mené et analysé des expériences optogénétiques. BY, XG et XSL ont effectué le séquençage de l'ARN-seq et du bisulfite à représentation réduite et les analyses correspondantes. BR, FRF, JAW ont mené des expériences et des analyses physiologiques in vitro. MS, OM, XSL et SR ont conçu le projet. MSXSL et SR ont rédigé le manuscrit. SLG a effectué des analyses statistiques. Tous les auteurs ont édité et commenté le manuscrit.

Correspondance avec X. Shawn Liu ou Steve Ramirez.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Rédacteur en chef de la manipulation principale : George Inglis. Ce manuscrit a déjà été évalué dans une autre revue Nature Portfolio. Le manuscrit a été jugé apte à être publié sans autre examen par Communications Biology.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Shpokayte, M., McKissick, O., Guan, X. et al. Les cellules de l'hippocampe séparent les engrammes positifs et négatifs. Commun Biol 5, 1009 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03906-8

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Reçu : 21 juin 2022

Accepté : 26 août 2022

Publié: 26 septembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-03906-8

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