Un lien entre la signalisation de l'agrine et Cav3.2 à la jonction neuromusculaire dans l'amyotrophie spinale

May 01, 2023

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 18960 (2022) Citer cet article

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Le déficit en protéine SMN provoque une maladie des motoneurones, l'amyotrophie spinale (SMA). Les thérapies basées sur le SMN améliorent les symptômes moteurs des patients à des degrés variables. Une des premières caractéristiques de la SMA est la perturbation de la jonction neuromusculaire (NMJ), une synapse entre un motoneurone et une cellule musculaire. La formation de NMJ dépend du regroupement des récepteurs de l'acétylcholine (AChR) déclenché par l'agrine et ses co-récepteurs de la protéine 4 liée au récepteur des lipoprotéines (LRP4) et de la voie de signalisation de la kinase spécifique du muscle transmembranaire (MuSK). Nous avons déjà montré que la flunarizine améliore les NMJ chez les souris modèles SMA, mais les mécanismes restent insaisissables. Nous montrons ici que la flunarizine favorise le regroupement de l'AChR de manière cellulaire autonome, dose et dépendante de l'agrine dans les myotubes C2C12. Ceci est associé à une augmentation des taux de protéines de LRP4, de l'intégrine-bêta-1 et de l'alpha-dystroglycane, trois co-récepteurs de l'agrine. De plus, la flunarizine améliore l'interaction de MuSK avec l'intégrine-bêta-1 et les phosphotyrosines. De plus, le médicament agit sur l'expression et l'épissage des gènes Agrn et Cacna1h de manière spécifique au muscle. Nous révélons que la protéine Cav3.2 codée par Cacna1h s'associe étroitement in vitro avec le co-récepteur d'agrine LRP4. In vivo, il s'enrichit à proximité des NMJ au cours du développement néonatal et le médicament augmente cet immunomarquage dans les muscles SMA. Ainsi, la flunarizine module les acteurs clés du NMJ et identifie Cav3.2 comme une nouvelle protéine impliquée dans la biologie du NMJ.

L'amyotrophie spinale (SMA) est caractérisée par la dégénérescence des motoneurones spinaux et l'atrophie musculaire. La SMA est causée par des mutations du gène du neurone moteur de survie 1 (SMN1) entraînant la réduction des niveaux de protéine SMN1,2. Cette protéine est une protéine de liaison à l'ADN/ARN exprimée de manière omniprésente impliquée dans la régulation de l'expression des gènes, y compris la transcription, l'épissage, le transport et la traduction de l'ARN, la fonction la plus caractérisée étant son rôle dans la biogenèse des petites ribonucléoprotéines nucléaires (snRNP) riches en U3, 4,5. Chez l'homme, la présence d'une copie du gène SMN2 fournit une protéine moins fonctionnelle en raison d'un épissage alternatif du dernier exon codant 76. En conséquence, des phénotypes SMA plus doux sont observés lorsque le nombre de copies du gène SMN2 augmente7,8. Les thérapies SMA approuvées sont dédiées à l'augmentation des niveaux de protéine SMN en utilisant soit la thérapie génique SMN, soit en ciblant le pré-ARNm SMN2 avec un oligonucléotide antisens (ASO) ou une petite molécule. Malgré ces formidables avancées scientifiques et cliniques, plusieurs patients sont incapables de prendre ces médicaments, d'autres y répondent mal et parfois, des effets indésirables sont observés9,10,11,12,13. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la maladie devrait contribuer à l'émergence de meilleures thérapies d'importance clinique.

Des défauts de la jonction neuromusculaire (NMJ) ont été observés dans la pathogenèse de la SMA avant la perte de motoneurones compatible avec un phénotype de "dépérissement"14,15,16. En effet, une maturation retardée, une plus petite surface de plaque motrice et une dénervation de la plaque motrice sont détectées chez les souris modèles SMA17,18,19. Une caractéristique des NMJ est le regroupement des récepteurs musculaires de l'acétylcholine (RACh) sur la membrane musculaire post-synaptique médiée par l'agrine sécrétée par les motoneurones20. L'agrine se lie au récepteur LRP4, puis le complexe agrin-LRP4 se lie et active le muSK transmembranaire favorisant le regroupement de l'AChR via des adaptateurs tels que la protéine d'amarrage 7 (Dok7)21,22. De plus, les souris dépourvues des gènes fonctionnels Agrn, Lrp4 ou Musk meurent en période périnatale.

Le gène Agrn produit plusieurs isoformes dans divers tissus en utilisant deux promoteurs et un épissage alternatif des exons codant pour les domaines de l'extrémité C-terminale, tels que les sites Y et Z23,24,25. Les premiers exons alternatifs codent soit pour l'extrémité N-sécrétoire (NtA) soit pour l'extrémité transmembranaire (Tm), cette dernière étant principalement exprimée dans les neurones alors que NtA est également exprimé dans des cellules non neurales telles que les muscles26. Les isoformes neurales d'agrine Z+ regroupent fortement les AChR par rapport à l'agrine Z- musculaire23. En tant que composants de la matrice extracellulaire (ECM), les agrines se lient également à la laminine, à l'héparine, à l'α-dystroglycane et aux intégrines β127,28. Ainsi, l'agrine est également impliquée dans une variété de fonctions : elle maintient le NMJ29, favorise la régénération cardiaque30, inhibe l'élongation des neurites31,32,33, régule la synaptogenèse dans le système nerveux central34 et coordonne une interférence entre les voies LRP4/MuSK et intégrine-β1 dans cancer du foie35,36.

Le rôle de la voie de signalisation agrine/LRP4/MuSK/Dok7 dans la maladie SMA a été souligné pour la première fois par l'observation que l'exon Z+ de l'agrine est mal épissé dans les motoneurones spinaux des souris modèles SMA37, ce qui peut être corrigé par la co-expression de l'AAV-9 Protéines Lsm10 et Lsm11 spécifiques de U738. La modulation de la signalisation de l'agrine par la surexpression d'une agrine Z+ transgénique, l'injection d'une agrine thérapeutique ou l'administration d'AAV-Dok7 atténue le phénotype des souris SMA39,40,41. De plus, l'anticorps agoniste de MuSK réduit les défauts neuromusculaires chez les souris SMA42. Ainsi, l'amélioration de la fonction NMJ par la signalisation de l'agrine a des effets thérapeutiques sur la pathogenèse chez les souris modèles SMA. Or, l'expression des exons Agrn autres que les exons Z+ reste largement inexplorée chez les souris SMA et après traitements.

L'implication des NMJ dans la maladie SMA a été davantage illustrée lorsque nous avons rapporté que la flunarizine augmente la surface de la plaque motrice et la maturation des NMJ et améliore le phénotype de la maladie chez les souris SMA, mais cela indépendamment des niveaux de snARN et d'exons Agrn Z+43. Le mode d'action exact sur le NMJ reste inconnu. La flunarizine était auparavant utilisée comme bloqueur des canaux calciques de type T44 et a été identifiée dans un crible chimique comme un régulateur d'épissage45. Les niveaux de calcium et le métabolisme de l'ARN sont modifiés dans les modèles SMA46,47,48,49,50,51. De plus, le traitement ASO des souris SMA atténue les défauts d'épissage des introns U12-dépendants de plusieurs gènes, dont Cacna1h codant pour le canal calcique de type T Cav3.247.

Nous avons alors envisagé une action de la flunarizine sur l'expression et l'épissage des gènes Agrn et Cacna1h dans les muscles squelettiques. Pour répondre à cette question, nous avons étudié comment la flunarizine augmente la taille du NMJ chez les souris témoins et modèles SMA. Étant donné que les effets du médicament dépendent du muscle et sont indépendants du SMN43, nous avons évalué les effets de la flunarizine sur des myotubes C2C12 murins en culture. Nous rapportons que le médicament stimule in vitro le regroupement AChR, un événement précoce dans la formation de NMJ. Cet effet a une dépendance à la concentration similaire à celle de l'inhibition du courant Cav3.2 suggérant qu'il nécessite un blocage des canaux. De plus, nous révélons in vitro et in vivo que l'expression et l'épissage des gènes Agrn et Cacna1h semblent être co-régulés par la flunarizine. Nous montrons également que le co-récepteur d'agrine LRP4 s'associe à Cav3.2 que nous retrouvons localisé à proximité des NMJs en période néonatale murine. Il est important de noter que l'immunomarquage Cav3.2 dans les muscles SMA est augmenté par la flunarizine. Par conséquent, nous proposons des effets de flunarizine pour associer Cav3.2 à la formation et à la maturation des NMJ périnataux.

Nous avons précédemment montré que la flunarizine agrandit les NMJ post-synaptiques indépendamment des niveaux de protéines SMN chez les souris témoins et modèles SMA43. Cela implique que les muscles pourraient répondre directement à la flunarizine. Pour tester cette idée, nous avons évalué si la flunarizine stimule in vitro la formation de clusters AChR dans des myoblastes de souris C2C12 en culture fusionnés pour former des myotubes (Fig. 1A). Les grappes d'AChR sont visualisées à l'aide d'une α-bungarotoxine fluorescente (α-BTX). La flunarizine (4 μM) a augmenté de manière significative de 3 à 4 fois le nombre et la taille des grappes (Fig. 1B, E). De plus, le regroupement induit par la flunarizine était dose-dépendant (Fig. 1C). La concentration semi-maximale (EC50) était de 1,3 μM et 4 μM ont donné des effets maximaux sur le regroupement. Nous avons également évalué la flunarizine sur le canal calcique de type T Cav3.2 dans des cellules HEK293 exprimant de manière stable (Fig. 1D). Les enregistrements électrophysiologiques ont révélé qu'une dépendance à la concentration de médicament similaire est trouvée pour la flunarizine sur l'activité du canal Cav3.2 (IC50 = 3,44 µM). Il convient de noter que l'évolution temporelle de l'inhibition de la flunarizine illustre qu'une inhibition maximale par 10 µM de flunarizine est atteinte après une période d'incubation de 5 minutes (Fig. 7 supplémentaire). Ainsi, la flunarizine stimule le clustering AChR très probablement par une action directe sur le canal Cav3.2, suggérant un rôle direct des cellules musculaires dans les effets bénéfiques du médicament chez les souris modèles SMA.

La flunarizine favorise le regroupement de l'AChR dans les myotubes C2C12 murins. (A) Représentation schématique des cultures et du traitement des cellules musculaires C2C12. (B) Imagerie par fluorescence des grappes d'AChR avec de l'α-bungarotoxine (α-BTX) sur des myotubes traités au DMSO et à la flunarizine (FZ). (C) Une courbe dose-réponse de la flunarizine du regroupement AChR (3 ≤ n ≤ 5 pour chaque concentration de 100, 250, 500, 1000, 4000 et 10 000 nM, sauf 2 pour 10 μM). (D) Courbe concentration-réponse des effets de la flunarizine sur les canaux Cav3.2. Pour chaque point, la densité de courant moyenne a été normalisée à la densité de courant moyenne du groupe véhicule (7 < n < 24 pour chaque concentration, les barres d'erreur sont SEM). (E) La taille et le nombre de grappes AChR ont augmenté avec le médicament. Les colonnes représentent le nombre de grappes pour le même nombre de myotubes par condition ont été analysées à l'aide d'ImageJ à partir de 3 expériences indépendantes (345 myotubes par condition). (F) Expression de protéines endogènes dans des extraits protéiques totaux de myoblastes C2C12 dans un milieu de prolifération (PM) et de myotubes traités au DMSO et FZ dans un milieu de différenciation pendant 7 jours (Diff7). Les cellules ont été récoltées après une nuit de traitement DMSO et FZ. La membrane de PVDF a été immunobuvardée avec les anticorps indiqués avec ou sans étape de décapage. L'α-tubuline sert de contrôle de charge. Une augmentation de 50 % des taux de protéine GAPDH est détectée par rapport au contrôle de la charge de tubuline avec le médicament. Les images non recadrées se trouvent dans la Fig. 3 supplémentaire. (G) Les colonnes représentent les changements de pli de l'expression des protéines dans les myotubes traités au FZ par rapport au traitement au DMSO (1 μl / ml). (H) Effets des anticorps bloquants contre l'agrine (anti-agrine), l'intégrine β1 (anti-ITGB1) et l'α-dystroglycane (α-Dg1) sur le regroupement de l'AChR en présence de flunarizine (FZ) par rapport au contrôle négatif IgG. (I) Les colonnes représentent le nombre de grappes (taille> 5 μm) à partir de 40 champs sélectionnés au hasard de chaque condition par expérience. Les barres d'erreur représentent SD à partir des valeurs moyennes de 3 expériences indépendantes. Le DMSO dilué est utilisé dans des conditions témoins car la flunarizine est insoluble en solution aqueuse. Test Khi-2, *, P < 0,05 ; **, P < 0,01 ; ***, P < 0,001. Barre d'échelle, 30 μm.

Pour disséquer les mécanismes de la flunarizine induisant le regroupement de l'AChR, nous avons examiné les niveaux de protéines des molécules clés du NMJ en nous concentrant sur la sous-unité AChRα, Lrp4, MuSK, les dystroglycanes (dg), la protéine kinase II dépendante de Ca2+/calmoduline (CaMKII), l'intégrine β1 et α11 dans C2C12. myotubes (Fig. 1F, G). Aucun effet de la flunarizine (4 μM) n'a été détecté sur les niveaux de protéines d'AChRα, MuSK et β-dystroglycane alors que des augmentations de 30, 50, 60 et 70% ont été observées pour Lrp4, β1 et α11 intégrines et épitope α-dystroglycane respectivement. Nous avons également examiné si la surexpression de la dynamine2 (Dyn2) induisait un regroupement AChR52 et régule le développement de NMJ53. Une augmentation des niveaux de protéines Dyn2 et GAPDH a été montrée avec la flunarizine. Aucun effet médicamenteux n'a été observé sur les niveaux de protéine CaMKII ou la phosphorylation, excluant une éventuelle implication de CaMKII, qui régule également l'expression et le regroupement de l'AChR54,55. Les niveaux de protéines SMN et Unrip (un autre composant du complexe SMN) sont restés inchangés, comme prévu56. Ainsi, la flunarizine peut favoriser la signalisation de l'agrine puisque Lrp4/MuSK, les intégrines β1 et l'α-dystroglycane sont tous des récepteurs de l'agrine impliqués dans la biologie du NMJ25.

La seule source d'agrine dans nos expériences provient des myotubes C2C12. Nous avons ensuite demandé si les anticorps qui bloquent l'agrine, l'intégrine-β1 ou l'α-dystroglycane affectaient le clustering AChR induit par la flunarizine. Les myotubes ont été traités avec le médicament et l'anticorps monoclonal de souris anti-agrine Mab520435 ou l'anticorps monoclonal de souris anti-intégrine-β1 Mab196557 ou l'anticorps monoclonal de souris anti-α-dystroglycane IIH6C458 ou un anticorps de souris témoin négatif (Fig. 1H, I) . Dans nos conditions, les anticorps Mab5204 et Mab1965 ont nettement inhibé le regroupement AChR, mais pas IIH6C4 et les anticorps témoins. En outre, l'α-dystroglycane est localisé dans tous les amas d'AChR dans les myotubes traités à la flunarizine (Fig. 4 supplémentaire), soutenant davantage un rôle dans la stabilisation des amas plutôt que dans la formation59. Ainsi, le regroupement de l'AChR induit par la flunarizine dépend de l'agrine et de l'intégrine-β1 in vitro.

Les résultats présentés jusqu'à présent indiquent que la flunarizine potentialise l'activité de regroupement AChR de l'agrine dérivée de C2C12. Nous avons ensuite évalué si le médicament pouvait avoir un impact sur l'expression du gène musculaire Agrn et ses isoformes épissées. Les agrines sont exprimées à partir de deux sites de départ transcriptionnels différents donnant lieu à deux N-terminales, NtA sécrétée ou TM transmembranaire, suivies d'une séquence commune et des exons alternatifs Y et Z codant pour la région C-terminale qui contient les sites de liaison de l'intégrine-β1 et LRP4, respectivement28 (Fig. 2A). Sachant que le site Z améliore grandement le clustering AChR60, il était possible que la flunarizine puisse favoriser l'inclusion des exons Z. En fait, nous illustrons qu'ils ne sont ni présents ni induits par le médicament dans les myotubes C2C12, excluant cette possibilité (Fig. 2B). Ainsi, nous avons constaté que le regroupement d'AChR induit par la flunarizine est indépendant de l'agrine Z +.

Effets de la flunarizine sur l'expression et le profil d'épissage du gène Agrn dans les myotubes C2C12 et les muscles squelettiques de souris modèles SMA. (A) Représentation schématique de la structure de l'agrine montrant l'utilisation alternative du premier exon de l'agrine associée à la lame basale soluble (NtA) ou du domaine couvrant la membrane et d'une courte région intracellulaire (TM) à l'extrémité N-terminale et les sites d'épissage "Y" et "Z" des extrémités C-terminales avec une représentation schématique des exons Y et Z du gène Agrn. (B) Analyse représentative par RT-PCR sur gel d'agarose des exons Agrn Z dans des myotubes C2C12 traités au DMSO et à la flunarizine (FZ) (Diff7). (C – E) L'analyse RT-qPCR de l'expression des exons NtA, Tm, ex5-6, ex29-30 et Y du gène Agrn est réalisée dans les myotubes C2C12 par rapport aux myoblastes dans le milieu de prolifération (PM). L'ARN total est préparé à partir de myoblastes C2C12 cultivés dans un milieu de prolifération (PM) ou après 7 jours dans un milieu de différenciation (J7) avec du DMSO ou de la flunarizine (FZ) pendant les 16 dernières heures. Les niveaux d'ARN dans (C), les rapports d'expression entre les exons et les niveaux d'ARN ex5-6 dans (D) et la proportion de NtA par rapport à TM dans (E) sont calculés. Ex5-6 est inclus dans tous les ARNm Agrn. PM a reçu une valeur arbitraire de 1 en C et D. (F – N) L'analyse RT-qPCR de l'expression de différents exons du gène Agrn est effectuée dans le soléaire (F), le plantaire (G) et le tibial (H) de souris témoins et modèles SMA à P10. Le véhicule témoin reçoit une valeur arbitraire de 1. Les proportions des premiers exons NtA par rapport à Tm sont calculées pour le soléaire (I), le plantaire (J) et le tibial (K). Les rapports d'expression entre les exons et les niveaux ex5-6 sont calculés pour le soléaire (L), le plantaire (M) et le tibial (N). Trois gènes sont utilisés comme contrôles pour la normalisation dans C2C12 (Ppia, Gapdh, 5S ou Dusp6, Rragc, 5S) et les muscles squelettiques (Rpl13a, Ppia, Myh4). Les barres d'erreur représentent SD à partir des valeurs moyennes des triplicats de 3 expériences indépendantes avec des cellules C2C12 et 3 souris par groupe. NS non significatif (P > 0,05), *P < 0,05, ** < 0,01, *** P < 0,001. Test t de Student.

Pour découvrir si d'autres isoformes Agrn pourraient être produites avec la flunarizine, nous avons conçu des amorces RT-qPCR pour les exons Agrn, à savoir NtA, Tm, ex5-6 (inclus dans toutes les isoformes), ex29-30 (région 3' de toutes les isoformes) et le inclusion de l'insert en Y (tableau supplémentaire 2). La différenciation C2C12 était associée à une diminution des niveaux totaux d'ARNm Agrn (ex5-6) et à une inclusion accrue de l'insert en Y (Fig. 2C). Les niveaux de NtA sont restés inchangés lors de la différenciation, mais les niveaux de Tm ont été nettement réduits. La flunarizine a réduit d'environ 25 % les niveaux d'exons NtA dans les myotubes C2C12, les rapports exon / ex5-6 étant inchangés (Fig. 2D). De plus, la proportion de NtA par rapport à Tm a montré qu'il y avait plus d'isoformes de NtA que de Tm (comme prévu) et qu'une augmentation de NtA par rapport aux isoformes de Tm est observée lors de la différenciation ainsi qu'une réduction par la flunarizine (Fig. 2E). Ainsi, nous avons constaté que le regroupement de l'AChR induit par la flunarizine est en corrélation avec les isoformes Y + Z− Agrn dans les myotubes C2C12.

Pour étudier l'expression d'Agrn dans les muscles squelettiques, nous avons exploré les niveaux d'exons d'Agrn dans trois muscles des membres postérieurs, à savoir le soléaire, le plantaris et le tibial de témoins traités avec le véhicule (V) et la flunarizine (FZ) (hétérozygotes) et des souris modèles SMA au jour post-natal. 10 (P10). Ces muscles diffèrent en terme de maturation, comme l'indique la proportion d'isoformes de myosine embryonnaire et néonatale, et par la composition en fibres de type I et de type II43. La maturation de deux muscles extenseurs (soléaire et plantaire) est altérée chez les souris modèles SMA alors que le fléchisseur tibial est moins affecté comme l'indique l'expression de la chaîne lourde de myosine néonatale17,43. Nous avons choisi un moment pour refléter des effets spécifiques plutôt que des changements ante-mortem dus à la mort du mutant à ≈12 jours43. Une réduction marquée de 60 à 80% des niveaux d'Agrn ex5-6 a été observée dans le SMA tibialis et soleus respectivement, tandis qu'une réduction modeste de ≈ 15% a été observée dans le SMA plantaris par rapport aux témoins (Fig. 2F – H). Les exons NtA et Tm ont été réduits dans SMA soleus alors que seul NtA était dans SMA plantaris et tibialis, indiquant une déficience des isoformes sécrétoires dans les muscles SMA restaurés avec de la flunarizine uniquement dans tibialis. En outre, la flunarizine a augmenté de manière similaire les niveaux d'exons Agrn dans le tibial témoin et SMA. L'exon NtA était préférentiellement exprimé par rapport à Tm chez les témoins et SMA soleus et tibialis, mais également trouvé dans SMA plantaris (Fig. 2I – K). Bien que les niveaux d'ex5-6 aient été réduits dans les SMA soleus et plantaris traités à la flunarizine, le rapport Tm / ex5-6 a été augmenté, ce qui indique que les deux sites d'initiation de la transcription ne sont pas sensibles de la même manière au médicament (Fig. 2L – N). De plus, le rapport exon Y/ex5-6 a montré avec la flunarizine une valeur similaire aux témoins dans SMA plantaris et tibialis, mais pas dans soleus. Ainsi, l'expression des isoformes Agrn est altérée chez les souris SMA d'une manière spécifique au muscle que la flunarizine module.

L'absence de corrélation complète entre les niveaux d'expression des isoformes Agrn (Fig. 2) et l'action de la flunarizine sur la taille du NMJ43 suggère que des événements supplémentaires contribuent aux effets du médicament. Étant donné que la flunarizine est classée comme un bloqueur des canaux calciques de type T Cav3.1, Cav3.2 et Cav3.3 codés respectivement par les gènes Cacna1g, Cacna1h et Cacna1i, nous avons ensuite recherché si le médicament pouvait moduler l'expression de Cacna1h. Il convient de noter que les transcriptions Cacna1g et Cacna1i étaient inférieures à nos limites de révélation et ne sont donc pas détectables. Ainsi, des amorces ont été conçues et validées pour l'analyse de l'expression et de l'épissage du gène Cacna1h : ex2-3 (exons flanquant un intron U12-dépendant), ex15-16 (inclus dans tous les ARNm de Cacna1h), ex25 (alternative spliced ​​exon 25) et amorces ex32-33 (région 3 'dans tous les ARNm de Cacna1h) (tableau supplémentaire 2, figure 3A). Les niveaux d'Ex15-16 étaient similaires entre les myoblastes et les myotubes C2C12, tandis que les niveaux d'ex2-3 et d'ex25 augmentaient avec la différenciation (Fig. 3B). La flunarizine a réduit les taux d'ex15-16 et d'ex25 de 50 et 40 % respectivement, mais n'a eu aucun effet sur les taux d'ex2-3 dans les myotubes. Nous avons ensuite évalué les rapports exon/ex15-16 (Fig. 3C). La valeur attendue de 1 a été obtenue avec le médicament pour le rapport ex32-33/ex15-16 alors qu'une augmentation ≈ 3 fois a été trouvée pour le rapport ex2-3/ex15-16, indiquant une augmentation relative de l'épissage de l'intron U12 dans les transcrits de Cacna1h. De plus, nous avons montré une réduction de 25% des niveaux de protéine Cav3.2 dans les myotubes C2C12 traités à la flunarizine (Fig. 3D). Nos résultats ont également confirmé la spécificité des anticorps utilisés ici. Parce que les introns U12 sont éliminés plus lentement que les introns U2, ils dictent les niveaux d'expression des transcrits matures61. Ainsi, la flunarizine diminue les niveaux d'ARNm de Cacna1h in vitro qui sont partiellement compensés par l'élimination de l'intron U12. La livraison de gènes snRNA mineurs améliore le phénotype de la maladie chez les souris SMA62. Bien que les niveaux d'ARNsn soient restés inchangés avec le médicament (Fig. 1 supplémentaire), nos données associent des spliceosomes U12 mineurs comme cibles potentielles du médicament dans les myotubes C2C12.

Effets de la flunarizine sur l'expression et le profil d'épissage du gène Cacna1h dans les myotubes C2C12 et les muscles squelettiques de souris modèles SMA. (A) Représentation schématique de l'intron U12 flanqué des exons 2 et 3 (ex2-3) et de l'exon épissé alternatif 25 du gène Cacna1h. (B) L'analyse RT-qPCR des niveaux d'ARN des exons ex2-3, ex15-16, ex25 et ex29-30 du gène Cacan1h est effectuée dans les myotubes C2C12 par rapport aux myoblastes dans le milieu de prolifération (PM). (C) Les rapports d'expression entre les exons et les niveaux d'ARN ex15-16, ex15-16 étant présent dans tous les ARNm de Cacna1h. L'ARN total est préparé à partir de myoblastes C2C12 cultivés dans un milieu de prolifération (PM) ou après 7 jours dans un milieu de différenciation (Diff7) avec du DMSO ou de la flunarizine (FZ) pendant les 16 dernières heures. (D) L'analyse par immunoblot de la protéine Cav3.2 codée par Cacna1h confirme une réduction significative de 20 % des niveaux de protéines dans les extraits protéiques totaux des myotubes C2C12 par la flunarizine (n = 3). Des images non recadrées se trouvent dans la Fig. 3 supplémentaire. (E – G) Les niveaux d'ARN des exons Cacan1h sont déterminés à P10 dans le soléaire, plantaire et tibial, respectivement. (H – J) Les rapports d'expression entre les exons et les niveaux d'ARN ex5-6 sont calculés pour le soléaire, le plantaire et le tibial, respectivement. Les barres d'erreur représentent SD à partir des valeurs moyennes des triplicats de 3 expériences indépendantes avec des cellules C2C12 et 3 souris par groupe. NS, non significatif (P > 0,05), *P < 0,05, ** < 0,01, ***P < 0,001. Test t de Student.

Ensuite, nous avons mesuré l'expression du gène Cacna1h dans les muscles squelettiques des souris témoins et SMA (Fig. 3E – J). Nous avons montré que les niveaux d'ex15-16 chez les mutants SMA ainsi que les effets de la flunarizine sur les témoins et les mutants étaient spécifiques au muscle. En effet, une triple réduction des niveaux d'ex15-16 a été observée dans SMA soleus, tandis qu'une augmentation ≈ 5 fois a été constatée dans SMA plantaris par rapport aux témoins (Fig. 3E – G). La flunarizine a réduit les niveaux élevés d'ex15-16 dans la SMA plantaris mais n'a pas rétabli les niveaux dans la SMA soléaire. De même, par rapport à ce qui a été observé avec le gène Agrn (Fig. 2H), le SMA tibialis a exprimé autant de niveaux d'ARNm de Cacna1h que les témoins et a augmenté de manière similaire avec le médicament (Fig. 3G). Les niveaux alternatifs d'ex25 ont été augmentés dans SMA plantaris et tibialis par rapport aux témoins alors qu'ils ont été réduits dans SMA soleus. La flunarizine a corrigé l'inclusion relative d'ex25 dans les ARNm de SMA tibialis mais l'a augmentée dans le plantaris témoin. Le rapport ex2-3/ex15-16 est resté faible dans les SMA soleus et plantaris traités à la flunarizine, indiquant que la rétention de l'intron U12 persistait. Il est important de noter que le rapport ex32-33/ex15-16 a montré une valeur de 1 dans le SMA plantaris traité à la flunarizine, suggérant une augmentation des ARNm de pleine longueur avec le médicament.

Le courant CaV3.2 a été détecté dans les myofibres néonatales murines63. Nous avons ensuite demandé si la distribution de Cav3.2 dans les myofibres était affectée par la flunarizine. À cette fin, nous avons effectué des expériences d'immunofluorescence de co-marquage en utilisant des anticorps anti-type I MyHC7 (fibres lentes de type I) et anti-Cav3.2 sur des coupes en série de contrôle et de SMA plantaris à P5 et P10 (Fig. 4A, Fig. 8). Les souris SMA commencent à développer des symptômes à P543. Les anticorps anti-Cav3.2 ont révélé un marquage cytoplasmique et membranaire des myofibres. La réduction de la fluorescence totale dans les myofibres de type I entre P5 et P10 a été observée dans toutes les conditions, à l'exception des témoins traités avec le véhicule (Fig. 4B). Les fibres SMA de type I traitées à la flunarizine ont récupéré la fluorescence cytoplasmique à P10 par rapport aux fibres SMA traitées avec le véhicule. La flunarizine n'a eu aucun effet sur l'intensité totale de fluorescence Cav3.2 des fibres MyHC7-négatives (vraisemblablement de type II rapide) chez les témoins, alors qu'une augmentation a été observée dans ces fibres SMA. Ainsi, chaque type de fibre répond différemment à la flunarizine.

La flunarizine empêche la réduction de l'immunomarquage de la myofibre Cav3.2 au cours du développement néonatal chez les souris SMA. (A) L'immunocoloration des fibres musculaires avec Cav3.2 (vert) et MyHC7 (rouge) est montrée pour les plantaires des souris témoins et SMA traitées au véhicule (V) et à la flunarizine (FZ) à P5 et P10, respectivement. Les images originales sont présentées dans la Fig. 8 supplémentaire. (B) L'intensité de fluorescence normalisée des fibres musculaires individuelles pour Cav3.2 détectée dans le panneau A est indiquée. Chaque symbole représente la valeur totale de l'intensité de fluorescence dans une fibre. La valeur moyenne de la fluorescence est dans la Fig. 9 supplémentaire. La distribution pour les 4 groupes de souris des fibres immunomarquées ou non marquées par MyHC7 est comparée à l'aide du test t de Student. NS non significatif (P > 0,05), *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (3 souris par groupe). Barre d'échelle, 50 μm.

Des études antérieures ont montré l'expression de Cav3.2 dans les motoneurones64,65, les vaisseaux sanguins66, les afférences sensorielles musculaires mais pas dans les cellules de Schwann67, et tous ces types de cellules étant présents dans les tissus musculaires. Nous nous sommes concentrés ici sur le marquage membranaire Cav3.2 des myofibres et des NMJ en examinant des sections musculaires marquées Cav3.2 à P10 contre-colorées avec un α-BTX fluorescent pour marquer les AChR (Fig. 5A – D). Nos expériences d'immunofluorescence ont montré dans des coupes musculaires P5 et P10 que l'immunoréactivité de Cav3.2 était proche de celle du marquage avec l'α-BTX fluorescent, indiquant que Cav3.2 est présent à proximité des NMJ. Nous avons également montré que la flunarizine améliorait l'immunocoloration de Cav3.2 à proximité des NMJ dans les muscles SMA (Fig. 5D). Ainsi, une distribution défectueuse de Cav3.2 dans les myofibres pourrait contribuer à la pathogenèse de la SMA.

La protéine Cav3.2 est enrichie à proximité de la jonction neuromusculaire et sa déficience est améliorée par la flunarizine dans les muscles des souris SMA. (A) Représentation schématique de l'immunomarquage Cav3.2 au NMJ post-synaptique. Motoneurone MN, cellules de Schwann SC, muscle squelettique SM. (B) L'expérience de fluorescence de Cav3.2 révèle un marquage à proximité des sites post-synaptiques d'un NMJ en utilisant la coloration α-BTX des AChR et dans son motoneurone dans des sections de cryostat de P5 plantaris de souris témoins traitées avec un véhicule. L'image est une coloration α-BTX focalisée. (C) L'expérience de fluorescence révèle l'accumulation de Cav3.2 à proximité des sites post-synaptiques des NMJ, comme en témoigne la coloration α-BTX des AChR dans des coupes cryostatiques de P10 plantaris de souris témoins (panneau supérieur), la réduction (panneau central) et la restauration chez des souris SMA avec de la flunarizine (panneau du bas). Barre d'échelle, 10 μm. (D) L'intensité de fluorescence moyenne normalisée de NMJ individuel pour Cav3.2 détecté dans le panneau B est indiquée. Chaque symbole représente la valeur moyenne de l'intensité de fluorescence de NMJ individuel. La fluorescence des fibres témoins traitées avec le véhicule à P5 reçoit une valeur arbitraire de 1. La distribution pour les 4 groupes de souris de NMJ immunomarqué Cav3.2 est comparée à l'aide du test de Mann – Whitney à l'aide de GraphPad. NS, non significatif (P > 0,05), *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (3 souris par groupe, total de 600 NMJ).

Pour examiner si la flunarizine module l'interaction protéique entre Cav3.2 et la voie agrine-LRP4-MuSK, les myotubes C2C12 ont été traités avec le médicament, fixés et évalués à l'aide d'un test de ligature des protéines de co-immunoprécipitation (PLA) dans la cellule avec des anticorps générés dans différents espèce et spécifique pour chaque protéine (Fig. 6). En nous concentrant sur les protéines critiques pour le clustering AChR, nous avons testé les paires suivantes : LRP4-MuSK, LRP4-Cav3.2, MuSK-intégrine β1, MuSK-phosphotyrosines, intégrines α11-β1 et Dyn2-intégrine β1. Les signaux positifs au PLA entre deux protéines à proximité (< 40 nm) sont apparus sous forme de points fluorescents qui peuvent être comparés entre les myotubes C2C12 traités au DMSO et à la flunarizine. Des signaux PLA spécifiques ont été détectés pour toutes les combinaisons. Les signaux positifs avec les combinaisons LRP4-Cav3.2 et LRP4-MuSK indiquaient des associations protéiques constitutives dans les myotubes C2C12. Nous avons également constaté que la flunarizine améliore l'association de l'intégrine-β1 avec MuSK et l'intégrine-α11, tandis que l'association Dyn2-intégrine-β1 était réduite (Fig. 6B). Bien que la phosphorylation de MuSK n'ait pas été détectée dans les fractions protéiques d'immunoprécipitation solubles (Fig. 10 supplémentaire), les signaux PLA générés avec MuSK et les phosphotyrosines ont été nettement augmentés par la flunarizine. Ainsi, la flunarizine modifie la ou les associations étroites des protéines NMJ clés.

Visualisation des interactions clés des protéines NMJ dans les myotubes C2C12 traités à la flunarizine. (A) Détection PLA in situ des interactions protéiques endogènes dans les myotubes C2C12 avec des anticorps spécifiques pour les paires de protéines suivantes : LRP4-MuSK, LRP4-Cav3.2, MuSK-intégrine β1, intégrine α11-β1, Dyn2-intégrine β1 et MuSK- phosphotyrosines. En tant que témoins négatifs, un anticorps primaire est omis ou remplacé par un anticorps témoin négatif (DAKO). Les signaux positifs PLA sont représentés par des points lumineux. (B) Le changement de pli dans l'intensité de fluorescence moyenne des myotubes C2C12 individuels détectés dans le panneau A est montré. Le nombre de myotubes analysés avec ImageJ se trouve dans le tableau supplémentaire 3. Barre d'échelle, 30 μm.

Les dommages oxydatifs pourraient également contribuer aux altérations du NMJ dans les maladies des motoneurones68. La flunarizine réduit le pro-oxydant TXNIP dans les fibroblastes de patients atteints de SMA56 comme le font d'autres inhibiteurs calciques dans les cellules bêta pancréatiques69. Fait intéressant, les transcrits de Txnip ont été régulés positivement dans les muscles sans cellules satellites (SC) par rapport aux muscles remplis de SC70, ce qui rappelle le nombre réduit de SC dans les muscles des souris SMA71,72,73. Nous avons examiné l'expression de Txnip dans les muscles de souris SMA traitées à la flunarizine (Fig. 7). La flunarizine a réduit les niveaux d'ARNm de Txnip régulés à la hausse dans les muscles SMA (Fig. 7A). Des expériences de co-marquage par immunofluorescence avec des anticorps dirigés contre TXNIP et MyHC7 (fibres de type I) ont révélé que toutes les myofibres néonatales étaient positives pour TXNIP, 2 % étant fortement marquées chez les témoins, tandis que 16 % étaient dans le soléaire SMA et réduites à 10 % avec la flunarizine (Fig. .7B,C). Cela correspond à une expression élevée de TXNIP dans les muscles de souris et de rats adultes désaffectés74. Ainsi, la flunarizine réduit les niveaux élevés d'ARNm de Txnip dans les muscles des souris SMA.

La flunarizine réduit les niveaux d'expression accrus de Txnip dans les muscles squelettiques des souris modèles SMA. (A) Niveaux d'ARN Txnip dans le soléaire, plantaire et tibial chez les témoins traités au véhicule (V) et à la flunarizine (FZ) (Ctrl) et les souris modèles SMA. Le contrôle traité par le véhicule (Ctrl V) reçoit une valeur arbitraire de 1. NS non significatif (P > 0,05), *P < 0,05, ** < 0,01, ***P < 0,001, test t de Student (3 souris par groupe ). (B) L'immunocoloration des fibres musculaires avec des anticorps anti-TXNIP (vert) et anti-MyHC7 (rouge) est montrée pour le soléaire des souris témoins et SMA traitées au véhicule et à la flunarizine à P11. (C) Les colonnes représentent le pourcentage de fibres fortement TXNIP-positives (3 souris par groupe). Les barres d'erreur représentent SD à partir des valeurs moyennes. Barre d'échelle, 30 μm.

Trois thérapies de restauration du SMN existent pour les patients atteints de SMA qui améliorent la survie et la fonction motrice, mais la réponse des patients aux traitements est variable. Ainsi, des cibles thérapeutiques supplémentaires devraient être identifiées pour optimiser les thérapies SMA existantes ou en mettre en œuvre de nouvelles. Nous avons précédemment montré que la flunarizine augmentait la taille des myofibres, la zone NMJ et l'innervation chez les souris modèles SMA43. Nous nous sommes concentrés ici sur les muscles squelettiques pour évaluer la flunarizine sur les NMJ. Nous montrons que la flunarizine peut moduler les voies de signalisation de l'agrine, impliquées dans la formation et la maturation des NMJ, fournissant un aperçu supplémentaire de la pathogenèse de la SMA.

Les modèles murins de maladies motoneuronales et les patients présentent des défauts de NMJ75,76. Le dysfonctionnement synaptique est un événement précoce de la SMA qui génère des changements dans les circuits sensori-moteurs77,78,79. La SMA est une neuropathologie rétrograde dans laquelle la dégénérescence des motoneurones commence au niveau des NMJ présynaptiques et progresse vers les corps cellulaires15. Dans les modèles de souris SMA sévères, le nombre de motoneurones est normal à la naissance et diminue autour du 3e jour postnatal à 580,81. La maturation postnatale du NMJ se produit au cours des 3 à 4 premières semaines après la naissance. Pendant cette période, les NMJ grossissent et leur morphologie passe de plaques ovales à perforées pour atteindre une forme de bretzel82. Le courant Cav3.2 est élevé dans les myofibres périnatales, diminue progressivement au cours des 3 à 4 semaines suivant la naissance et est indétectable dans les muscles adultes, sauf pendant la régénération et la réparation musculaires63. Cette période de développement présente des exigences élevées en matière de SMN et correspond au moment où le phénotype moteur causé par un déficit en SMN peut être sauvé par des thérapies basées sur le SMN83,84,85. C'est également lorsque les thérapies indépendantes du SMN améliorent le phénotype de la maladie12,43,86,87,88.

La voie agrine/LRP4/MuSK stimulée améliore la SMA et la sclérose latérale amyotrophique (SLA)89. L'agrine est une molécule clé dans la biologie des NMJ post-synaptiques. Les changements dans les isoformes de l'agrine ont un impact sur la formation, la maturation et la stabilité des NMJ23. Le gène Agrn a des exons Y et Z épissés alternatifs. Les isoformes avec des sites Z (Z+) sont synaptogènes au niveau des NMJ alors que les isoformes sans eux (Z-) ont peu d'activité de regroupement AChR in vivo90. Les motoneurones expriment l'agrine Z+ contrairement aux cellules musculaires. La z-agrine a également des fonctions : elle peut moduler la phosphorylation de l'AChR91, stimuler l'expression du gène AChR92,93 et, dans certaines conditions, induire le regroupement de l'AChR60,94,95. La z-agrine peut se lier aux protéines de surface des cellules myotubes, telles que la molécule d'adhésion des cellules neurales, l'α-dystroglycane, les laminines et les intégrines28,96,97,98,99. L'agrine Z+ peut également lier ces protéines, mais l'α-dystroglycane lie plus fortement l'agrine Z- que l'agrine Z+. De plus, le site Y modifie les interactions, l'agrine Y–Z− présentant la liaison la plus élevée à l'α-dystroglycane90. Le site Y modulé par la flunarizine implique également une activité α-dystroglycane dans la réponse des muscles SMA.

Au jour 10 post-natal, chaque muscle squelettique est très différent en terme de maturation. Le MyHC embryonnaire persiste pendant un certain temps après la naissance. Le soléaire est le muscle le moins mature, car on trouve une plus grande proportion de fibres embryonnaires (60 %) que dans le plantaire (30 %) et le tibial (20 %)43. Deux promoteurs Agrn produisent des transcrits avec le premier exon NtA ou Tm codant pour les isoformes sécrétées ou transmembranaires, respectivement. Les motoneurones et les myofibres expriment l'exon NtA, codant pour un domaine de liaison à la laminine27. Il a été démontré que les motoneurones déficients en Smn dérivés de souris SMA ne répondent pas aux laminines100, ce qui est cohérent avec une réduction de la NtA-agrine. La réduction marquée de NtA que nous avons également observée dans les muscles SMA indique une expression altérée dans les deux types de cellules. Les exons NtA et Tm ne sont pas affectés de la même manière dans les muscles SMA et réagissent différemment au médicament d'une manière spécifique au développement / au muscle, les tibialis SMA plus matures se comportant comme des témoins. L'exon Tm in vivo est exprimé presque exclusivement par les neurones27 et dans les muscles, par les neurones innervant les myofibres. Différents niveaux d'exons Tm sont observés parmi les muscles SMA, suggérant une différence dans les motoneurones squelettiques101 et/ou dans les signaux rétrogrades des myofibres14.

Bien qu'un niveau seuil d'exon de Tm soit corrélé aux effets de la flunarizine sur la taille de la NMJ dans le SMA plantaris et le tibialis43, des mécanismes supplémentaires doivent être pris en compte pour expliquer comment il se produit dans le SMA plantaris (niveaux de Tm similaires entre le véhicule et la flunarizine). Il a été démontré que le site Y module la Tm-agrine au niveau des spécialisations de type synapse excitatrice dans le système nerveux central34. Ces auteurs ont proposé qu'une interaction indirecte de Tm-agrine et de LRP4 soit nécessaire pour regrouper les protéines au niveau de la membrane post-synaptique. Il est possible que Cav3.2 puisse médier des interactions indirectes. D'autres études ont montré que l'intégrine-β1 pourrait médier l'interaction entre l'agrine et l'α-dystroglycane28,57. Il est donc tentant de supposer que Cav3.2 pourrait être un co-récepteur d'agrine dans la différenciation post-synaptique précoce du NMJ.

En ce qui concerne le gène Cacna1h (codant pour Cav3.2), son épissage d'intron dépendant de U12 du gène Cacna1h est altéré chez les souris SMA47. La maladie des motoneurones SLA et une amyotrophie congénitale sévère sont associées à des variantes génétiques de Cacna1h comme facteurs de risque102,103,104,105. Fait intéressant, d'autres types de canaux calciques, à savoir de type P/Q, limitent la localisation et l'activation de MuSK et empêchent le regroupement des AChR dans les domaines extra-synaptiques des myofibres106. Il est intéressant qu'un bloqueur des canaux calciques de type T puisse moduler l'expression de Cacna1h au niveau de l'ARN et des protéines. La raison pourrait être la faible sélectivité du médicament pour les canaux Cav3107. Il est tentant de supposer que l'inhibition des canaux de type T explique en partie les effets de la flunarizine. L'action prolongée de la flunarizine sur l'inhibition du courant Cav3.2 confirme le rôle de ce canal (Fig. 7 supplémentaire). La flunarizine pourrait favoriser une boucle de rétroaction sur l'expression de Cacna1h en modifiant les niveaux intracellulaires de Ca2+ qui neutralisent les défauts de NMJ dans le SMA plantaris et le tibialis. Ceci est en accord avec le rôle du métabolisme altéré de l'ARN dans la SMA et l'ALS108 et les effets de la flunarizine sur l'épissage de l'ARN45. Nos résultats ont également une large pertinence dans d'autres maladies humaines suggérant que la flunarizine pourrait être délétère chez les jeunes patients atteints d'une canalopathie causée par des mutations Cav3.2 dominantes négatives109.

Le calcium est un régulateur clé de la biologie du muscle squelettique. La formation et le maintien des grappes d'AChR impliquaient le calcium intracellulaire et extracellulaire110,111. Dans les muscles murins, le courant Cav3.2 culmine autour du jour embryonnaire E16 qui coïncide avec l'étape de maturation NMJ embryonnaire tardive. En effet, des clusters AChR aneuraux sont présents à E11-12.5, puis l'innervation a lieu (E12.5-E14) et les clusters aneuraux se dispersent à E14-E17 et seuls les clusters innervés restent sur les myofibres20. La myogenèse se produit également dans cette période. De E14.5 à la naissance, les myoblastes adhèrent et fusionnent aux fibres primaires pour former des myofibres secondaires112. Le courant Cav3.2 est activé in vitro lorsque les myoblastes fusionnent pour former des myotubes113. Cela peut expliquer la taille réduite des muscles chez les souris SMA. Le nombre réduit de myofibres dans SMA soleus et plantaris43 est en corrélation ici avec les niveaux réduits d'ARN Cacna1h. La flunarizine augmente la taille et le nombre de fibres pour réduire l'atrophie de l'amyotrophie soléaire, mais seulement la taille des fibres pour corriger l'atrophie de l'amyotrophie plantaire43. La croissance musculaire postnatale se produit normalement par des augmentations de la surface des fibres, mais pas du nombre de fibres20,114. Ces observations pourraient indiquer une différence dans les types de myofibres et leur expression respective de Cav3.2, comme on le voit ici. Le soléaire présente une proportion de 50 à 50 % de fibres lentes de type I et rapides de type II. Le plantaris et le tibialis contiennent une petite proportion de fibres de type I (10 à 20 %) qui disparaît presque complètement au cours du développement postnatal. Les niveaux de calcium au repos sont plus élevés dans les fibres lentes que dans les fibres rapides. Par conséquent, les transitoires de calcium ont des effets différents dans les deux fibres en raison des différences de niveau dans les protéines contrôlant l'homéostasie du calcium. Le calcium peut activer la calcineurine phosphatase régulée par la calmoduline et peut activer les protéases dépendantes du calcium. Dans les myofibres lentes, la calcineurine régule la translocation nucléaire du facteur de transcription NFATc1 contrôlant le programme des gènes lents. De plus, l'augmentation de l'afflux de calcium via Cav3.2 induit une signalisation hypertrophique de la calcineurine cardiaque/NFAT115. Étant donné que la gestion du calcium est altérée dans le SMA50, la flunarizine pourrait moduler l'expression d'autres gènes musculaires encore à identifier dans le futur.

Notre observation de Cav3.2 se trouve à proximité de LRP4 dans les myotubes C2C12 soulève la question de sa localisation potentielle à proximité des NMJ au cours du développement périnatal. Nous pouvons spéculer mais ne comprenons pas encore complètement pourquoi Cav3.2 est localisé à proximité des NMJ. Une caractéristique intéressante de Cav3.2 est l'existence d'un domaine de liaison PDZ dans son extrémité C-terminale cytoplasmique116. Les protéines PDZ pourraient contrôler l'activité des canaux calciques, réguler leur densité de membrane plasmique et influencer les voies de signalisation en aval117. Plusieurs protéines d'échafaudage PDZ se trouvent au NMJ post-synaptique, y compris la synthétase d'oxyde nitrique neuronale (nNOS) et l'α-syntrophine118,119, MAGI-1c120 et le domaine PDZ contenant le doigt RING 3 (PDZRN3)121. Ainsi, la localisation NMJ de Cav3.2 peut être expliquée par le rapport précédent selon lequel le domaine PDZ de nNOS interagit in vitro avec le domaine de liaison PDZ de Cav3.2122. Ceci est particulièrement intéressant dans le contexte de la SMA et de la SLA, où l'immunocoloration pour la nNOS est réduite/abolie au niveau du sarcolemme des fibres atrophiques dans les biopsies musculaires des patients et préservée au niveau des fibres hypertrophiques (indiquant l'innervation) dans les biopsies SMA123,124. Ce résultat est remarquable à bien des égards avec les effets de la flunarizine sur les muscles des souris SMA. L'activité nNOS régule l'homéostasie calcique125, favorise le regroupement AChR in vivo et agrandit NMJs126. En ce qui concerne le développement de NMJ, l'induction Wnt du clustering AChR est complexe. L'analyse de l'ARN a identifié l'expression de Wnt4 et Wnt9a dans les myotubes C2C12127 qui ne sont pas modifiées par la flunarizine, pas plus que les sous-unités AChR et les cibles YAP en aval (Figs. 5 et 6 supplémentaires). L'exploration du rôle des Wnt dans le regroupement de l'AChR induit par la flunarizine pourrait fournir des informations supplémentaires à l'avenir. Compte tenu des quelques voies dérégulées dans les muscles squelettiques des embryons de souris SMA128 avec des voies musculaires dérégulées après la naissance37,88,129,130, nos résultats soulignent l'importance d'étudier les effets des médicaments au cours du développement néonatal chez les souris SMA. Avec une meilleure compréhension des réponses à la flunarizine, il pourrait être possible d'étendre les traitements existants aux thérapies combinées contre les maladies des motoneurones.

Les cellules musculaires C2C12 ont été cultivées sur des boîtes de culture TPP dans du DMEM-glutamax additionné de 20 % de sérum de veau fœtal (FCS) et de pénicilline et de streptomycine (100 unités/ml) et différenciées dans du DMEM-glutamax contenant 2 % de sérum de cheval. Après 6 jours dans un milieu de différenciation, les myotubes ont été traités pendant une nuit avec de la flunarizine (4 μM, comme recommandé par Sigma-Aldrich pour la bibliothèque Lopac L6912, courant calcique Cav3.2 IC50) ou du DMSO (1 μl/ml) comme le montre schématiquement la Fig. 2a . Pour les expériences utilisant des anticorps bloquants (1:100, selon la littérature), ils ont été ajoutés aux myotubes une heure avant les molécules. Pour la microscopie à fluorescence, les myotubes ont été rincés avec du PBS et fixés pendant 15 min à température ambiante avec 3 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4 et rincés dans du PBS. Les grappes d'AChR ont été visualisées à l'aide de l'α-bungarotoxine conjuguée Alexa Fluor 488 ou 555 (2 μg / ml, Molecular Probes). Pour le transfert Western, les extraits protéiques totaux ont été résolus sur un gel de polyacrylamide ProSieve 50 à 10 % (FMC Bioproducts, Rockland, ME) dans un tampon Tris-Tricine, transférés sur des membranes PVDF (Millipore) et incubés avec des anticorps répertoriés dans le tableau supplémentaire 1. Après l'étape de lavage de l'incubation avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP, les protéines ont été visualisées par chimiluminescence (Amersham ECL, GE Healthcare) et quantifiées à l'aide de l'analyse sur gel d'ImageJ. Pour les enregistrements électrophysiologiques, des HEK293 exprimant de manière stable hCaV3.2 ont été cultivés dans du DMEM à haute teneur en glucose complété avec 10 % de FBS, 1 mM de L-glutamine, 1 mM de pénicilline/streptomycine et complété avec 800 µg/ml de généticine G418.

Pour les enregistrements électrophysiologiques, les cellules trypsinées ont été centrifugées à 800 tr/min pendant 4 min et remises en suspension (≈ 350 000 cellules ml-1) dans une solution extracellulaire de patch-clamp. Des enregistrements de cellules entières ont été utilisés pour étudier les effets de la flunarizine sur les cellules HEK293 exprimant Cav3.2. Des enregistrements patch-clamp automatisés ont été effectués à l'aide du SyncroPatch 384PE de Nanion (München, Allemagne). Des puces à trous simples de résistance moyenne (n = 384) ont été utilisées pour les enregistrements électrophysiologiques. La génération d'impulsions et la collecte de données ont été réalisées avec le logiciel PatchControl384 v1.9.7 (Nanion) et l'interface Biomek (Beckman Coulter). Des enregistrements de cellules entières ont été effectués selon les procédures recommandées de Nanion. Les cellules ont été stockées dans un réservoir d'hôtel cellulaire à 10 ° C avec une vitesse d'agitation de 60 tr/min. Après le début de l'expérience, la capture de cellules, le scellement, la formation de cellules entières, l'application de liquide, l'enregistrement et l'acquisition de données ont tous été effectués séquentiellement et automatiquement. La solution intracellulaire contenait (en mM) : 10 CsCl, 110 CsF, 10 NaCl, 10 EGTA et 10 HEPES (pH 7,2, osmolarité 280 mOsm), et la solution extracellulaire contenait (en mM) : 60 NMDG, 80 NaCl, 4 KCl , 10 CaCl2, 1 MgCl2, 5 Glucose et 10 HEPES (pH 7,4 avec NaOH). Des expériences sur cellules entières ont été réalisées à un potentiel de maintien de -100 mV à température ambiante (18 à 22 ° C). Les courants ont été échantillonnés à 20 kHz. Pour les dosages pharmacologiques, des solutions de flunarizine ont été préparées à différentes concentrations dans la solution extracellulaire additionnée de 0,3% d'albumine de sérum bovin, et réparties dans des plaques composées de 384 puits selon un plan de plaque préétabli. Cette répartition au sein des plaques composites ne pourrait pas être randomisée car elle complexifierait par la suite excessivement les méthodes d'analyses. La solution de composé de travail a été diluée 3 fois dans le puits d'enregistrement patch-clamp en ajoutant 30 à 60 µL de solution externe pour atteindre la concentration finale rapportée et le volume de test de 90 µL. Pour les groupes témoins, les solutions de véhicule étaient extracellulaires contenant 0,3 % de BSA et 0,1 % de DMSO (ce qui était similaire à la concentration de DMSO dans la solution de flunarizine 10 µM). Les effets de la flunarizine ont été mesurés tout au long d'une application de 10 minutes avec un protocole en une seule étape contenant une période de potentiel de maintien de 50 ms à 100 mV suivie d'une impulsion de 400 ms à -10 mV. Ce protocole en une seule étape a été répété avec un intervalle de 10 s.

Les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux directives ARRIVE et aux protocoles approuvés par le comité de protection des animaux de l'Université de Paris (CEEA 34) respectant les directives européennes et françaises pour les soins et les utilisations des animaux de laboratoire (2010/63/UE) sous les numéros de référence 01246.02 et B75-06-07. Les souris SMA taïwanaises ont reçu une injection quotidienne depuis la naissance de flunarizine (500 µg/ml, 1 µl/g) ou de véhicule (1 % de DMSO dans une solution saline) comme décrit43. Les souris SMA sont sur fond FVB/NRj (Janvier, Le Genest-St-Isle, France) et rétrocroisées depuis 10 générations comme décrit. Un numéro a été attribué à chaque animal et, sauf indication contraire, les expériences ont été réalisées en aveugle pour le génotype, le traitement et les études moléculaires et cellulaires. L'allocation de groupe a été divulguée pour les analyses. Aucun critère d'exclusion n'a été utilisé. Les femmes et les hommes ont été inclus dans l'étude. Le modèle taïwanais sévère de SMA (Smnko/ko ; SMN2tg/0) et les souris hétérozygotes témoins correspondantes (Smnko/wt ; SMN2tg/0) ont été produites dans la même portée. Sur la base de nos résultats précédents43, nous avons étudié trois souris par groupe expérimental afin de minimiser le nombre d'animaux utilisés. Les quatre groupes étaient des souris témoins et des souris modèles SMA traitées au véhicule et à la flunarizine pour un total de 59 souris. Les souris ont été génotypées avec les amorces PCR S1, S2, H1, 2B et 2F131. En bref, une réaction de PCR multiplex a été mise en place avec 1 µl d'ADN (20 ng), 5 µl de tampon flexi GoTaq vert 5X, 2,5 µl de MgCl2 25 mM (2,5 mM final), 1 µl de mélange de dNTP 10 mM (2,5 mM chaque dNTP, 200 µM final), 1,5 µl d'amorce sens S2 10 µM (0,6 µM final), 0,75 µl d'amorce sens 10 µM 2F (0,3 µM final), 0,75 µl d'amorces inverses 10 µM S1, H1, 2B (0,3 µM final) et 0,15 µl GoTaq ADN polymérase (Promega). Les conditions d'amplification étaient les suivantes : 5 min à 95 °C puis 30 s à 95 °C, 1 min à 58 °C, 45 s à 72 °C pendant 33 cycles et une étape finale d'extension de 5 min à 72 °C. Les produits PCR S2-S1 (1150 pb), S2-H1 (950 pb) et 2F-2B (478 pb) ont été analysés sur gel d'agarose 1%. Les mutants SMA et leurs congénères hétérozygotes ont été anesthésiés par des injections intrapéritonéales de pentobarbital (64 mg/kg) et décapités à P5 ou P10. Trois muscles squelettiques (soléaire, plantaire, tibial) ont été disséqués, congelés et stockés à -80 ° C. Les expériences d'immunofluorescence sur des cryosections musculaires (10 μm) ont été réalisées comme nous l'avons détaillé précédemment43. En bref, les sections ont été fixées dans du PFA à 4 % dans du PBS pendant 20 min, bloquées dans du FCS à 20 % ou du BSA à 4 % pendant 30 min et incubées avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 °C. Après 1 h dans du PBS-Tween (0,1 %), les coupes ont été incubées pendant 2 h avec des anticorps secondaires. Après coloration et lavages au bis-benzimide (ou DAPI), les coupes ont été montées avec une solution fluoromount-G. Les anticorps utilisés sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 1.

Les images ont été prises à l'aide d'une caméra ORCA Flash 2.8 (Hamamatsu Photonic) montée sur un système de microscope à épifluorescence (AxioObserver Z1, ZEISS). Les logiciels ZEN et ImageJ ont été utilisés pour acquérir et analyser les images, respectivement. En bref, les régions d'intérêt (ROI) ont été sélectionnées au hasard et dessinées manuellement à l'aide des images de canal à fond clair avec ImageJ. Pour les analyses d'intensité de fluorescence des fibres musculaires, le niveau de seuil a d'abord été ajusté pour supprimer tout signal de fond et les valeurs de gris moyennes des fibres musculaires marquées au Cav3.2 ont été mesurées pour les fibres de type I marquées ou non marquées (vraisemblablement de type II ) pour chaque groupe de souris.

La taille des clusters AChR dans les myotubes C2C12 a été déterminée avec ImageJ par la mesure des agrégats AChR (≥ 6 à 10 μm) dans des champs de microscope 20 × sélectionnés au hasard (40 champs par expérience, n ≥ 3 expériences indépendantes) ou à partir d'une centaine de fibres par expérience (n = 3).

Le test de ligature de proximité in situ (PLA) a été effectué comme nous l'avons décrit132. En bref, les cellules C2C12 ont été fixées et perméabilisées comme ci-dessus. Les anticorps primaires (tableau supplémentaire 1) ont été dilués dans le diluant d'anticorps (kit DuolinkII, Sigma-Aldrich) et incubés pendant une nuit à 4 ° C. Les contrôles négatifs consistaient à utiliser un seul anticorps primaire. Les cellules ont été lavées deux fois pendant 5 min dans une solution saline tamponnée au Tris avec 0,05 % de Tween. Les sondes PLA (souris-PLUS et lapin-MINUS) ont été incubées pendant 1 h à 37 °C. Les étapes suivantes ont été réalisées à l'aide du réactif de détection Orange. Les signaux ont été visualisés sous forme de points avec un microscope à fluorescence et analysés avec ImageJ.

L'ARN total a été extrait des tissus et des cultures cellulaires à l'aide du réactif Trizol (Ambion) et traité avec une DNase sans RNase RQ1 (Promega). Un µg d'ARN a été utilisé pour générer de l'ADNc avec le kit miScript II RT (Qiagen) pour les analyses d'ARNsn et Superscript III (Invitrogen) pour les autres gènes. Une PCR quantitative en temps réel a été réalisée en trois exemplaires à l'aide des amorces répertoriées dans le tableau supplémentaire 2 avec le mélange SYBR Green ROX (Thermo Scientific) sur le système rapide Applied Biosystems 7500 ou BioRad CFX384. Les niveaux d'expression normalisés ont été calculés selon la méthode ΔΔCt. Les amorces snRNA, 5S, 5.8S, Rpl13a, Ppia, Gapdh, Myh4 et Z+ Agrn et leurs analyses ont été décrites précédemment43. Des amorces supplémentaires ont été conçues à l'aide des outils gratuits de conception d'amorces d'eurofins (eurofinsgenomics.eu) et validées selon les directives MIQE.

Au moins trois expériences indépendantes ont été présentées comme la moyenne ± SD ou SEM. Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du test de Kruskal Wallis non paramétrique suivi du test de rang de comparaison multiple de Dunn ou de l'ANOVA à deux facteurs suivi du test de comparaisons multiples de Tukey ou du test t de Student (GraphPad). Le test utilisé a été indiqué dans les légendes des figures. Le seuil significatif était de 5 %.

Les calculs détaillés effectués pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions la plate-forme de BioMedTech Facilities INSERM US36 | CNRS UMS2009 | Université de Paris Cité pour l'assistance en expérimentation animale, biologie moléculaire et microscopie. Nous tenons à remercier les Pr R Barouki, J Cartaud et F Charbonnier pour leur soutien constant. Nous remercions M Nabi et PE Fontaine pour leur aide technique lors de leur stage universitaire. Nous sommes reconnaissants à nos collègues pour la lecture critique du manuscrit et la généreuse fourniture de protocoles et de réactifs.

This work was supported by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM, facilities and salary to S.L.), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, facilities) and Université Paris Cité (facilities and salary to P.D., B.S. and D.S.). The grants CONV-16-SMA-Lefebvre and ANR-21-CE17-0039-01 to S.L. is from SMA Europe and ANR, respectively.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Perrine Delers et Delphine Sapaly.

T3S, INSERM, Université Paris Cité, 75006, Paris, France

Perrine Delers, Delphine Sapaly, Badih Salman & Suzie Lefebvre

L’institut du Thorax, INSERM, CNRS, Nantes Université, 44000, Nantes, France

Stéphan De Waard & Michel De Waard

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PD, DS, BS, SDW, MDW et SL ont réalisé des expériences. PD, DS, BS, SDW, MDW et SL ont effectué des analyses. SL a conçu le projet et écrit le manuscrit. Tous les auteurs ont commenté le manuscrit.

Correspondance à Suzie Lefebvre.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Delers, P., Sapaly, D., Salman, B. et al. Un lien entre la signalisation de l'agrine et Cav3.2 à la jonction neuromusculaire dans l'amyotrophie spinale. Sci Rep 12, 18960 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23703-x

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Reçu : 20 janvier 2022

Accepté : 03 novembre 2022

Publié: 08 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-23703-x

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