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Dec 29, 2023

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 7241 (2022) Citer cet article

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Le myophage jumbo Klebsiella ϕKp24 présente un arrangement inhabituellement complexe de fibres de queue interagissant avec une cellule hôte. Dans cette étude, nous combinons des méthodes de cryo-microscopie électronique, des méthodes de prédiction de la structure des protéines, des simulations moléculaires, des approches microbiologiques et d'apprentissage automatique pour explorer la capside, la queue et les fibres de queue de ϕKp24. Nous déterminons la structure de la capside et de la queue à une résolution de 4,1 Å et 3,0 Å. Nous observons que les fibres de la queue sont ramifiées et réarrangées de façon spectaculaire lors de la fixation à la surface cellulaire. Cette configuration complexe implique quatorze fibres de queue putatives avec une activité de dépolymérase qui confèrent à ϕKp24 la capacité d'infecter un large éventail de types de polysaccharides capsulaires (CPS) de Klebsiella pneumoniae. Notre étude fournit un aperçu structurel et fonctionnel de la façon dont ϕKp24 s'adapte aux surfaces variables des agents pathogènes bactériens encapsulés, ce qui est utile pour le développement d'approches de phagothérapie contre les souches de K. pneumoniae résistantes aux médicaments.

Les bactéries pathogènes représentent une menace croissante pour la santé humaine. Alors que de nombreuses infections bactériennes peuvent être efficacement guéries par des antibiotiques, la résistance aux antimicrobiens (RAM) se traduit de plus en plus par des traitements inefficaces. Une étude récente a fait état de 3,57 millions de décès associés à la RAM chez six principaux agents pathogènes en 20191. Parmi ceux-ci figure Klebsiella pneumoniae, un agent pathogène reconnu par l'Organisation mondiale de la santé comme prioritaire 1 (critique) pour le développement de nouveaux antibiotiques2. K. pneumoniae peut provoquer une pneumonie, une infection des voies urinaires, une bactériémie et d'autres maladies infectieuses chez l'homme, en particulier chez les personnes dont l'immunité est compromise3. La grande majorité des isolats cliniques de K. pneumoniae expriment une capsule prononcée qui est généralement considérée comme un facteur de virulence important assurant la protection contre le système immunitaire de l'hôte4. Il existe plus d'une centaine de types de locus capsulaires génétiquement distincts, dont 77 structures chimiques bien caractérisées sont utilisées dans le sérotypage (types K)5.

Même si les K. pneumoniae multirésistants sont insensibles aux antibiotiques de référence, ils restent sensibles aux infections bactériophages. Les bactériophages, ou phages en abrégé, sont des virus qui infectent les bactéries. Les phages spécifiques de Klebsiella peuvent infecter et tuer avec succès leur hôte naturel ; cependant, la plupart de ces phages sont généralement très spécifiques à la souche en raison des polysaccharides capsulaires variables (CPS) de cette espèce, qui agissent comme un récepteur de phage primaire. Les phages Klebsiella dépendants de la capsule, y compris les phages ΦK64-1 ou vB_KleM-RaK26,7, sont équipés de fibres de queue ou de pointes de queue servant de protéines de liaison aux récepteurs (RBP) contenant des domaines enzymatiques dégradant le CPS (coined capsule dépolymérases) qui permettent une adsorption réussie du phage et infection8. Par souci de simplicité, nous utiliserons désormais le terme "fibre de queue".

Les bactériophages à queue avec des génomes de> 200 kbp d'ADN sont définis comme des phages jumbo9. Les caractéristiques structurelles les plus notables des phages jumbo sont de grandes capsides qui encapsulent leur génome10. Le myophage jumbo vB_KpM_FBKp24 (ϕKp24) récemment décrit code pour au moins neuf fibres de queue contenant différents domaines de dépolymérase, ce qui suggère une gamme d'hôtes étendue. L'analyse génomique a révélé que ϕKp24 a une similitude très limitée avec tout autre phage11 connu et constitue donc une nouvelle famille appelée Vanleeuwenhoekviridae (classification ICTV en cours). De plus, la microscopie électronique à transmission a révélé une structure complexe unique de fibres de queue au niveau de la plaque de base. Cependant, des informations plus détaillées sur la structure et la fonction de cet ensemble unique de fibres de queue font actuellement défaut.

Pour mieux comprendre la structure inhabituelle de ϕKp24, nous avons analysé ses fibres de capside, de queue et de queue à l'aide de différentes méthodes structurelles. Nous avons généré des modèles atomiques pour la capside et la queue de phage hautement ordonnées à l'aide d'une analyse de particules uniques (SPA) par microscopie cryoélectronique (cryo-EM) combinée à des prédictions de structure de protéine AlphaFold212 et à des simulations de dynamique moléculaire (MD). Les données ont révélé des caractéristiques inhabituelles de la capside de ϕKp24, notamment la composition de la capside entière par un seul MCP et la présence d'un pore au centre des hexagones. Nous avons obtenu un aperçu de la structure des fibres de queue flexibles et désordonnées en utilisant la tomographie cryo-électronique (cryo-ET). Cette analyse a été facilitée par des approches d'apprentissage automatique pour former un réseau de neurones afin de suivre automatiquement les fibres de queue complexes pour une analyse quantitative des données de tomographie. Notre analyse a révélé un réarrangement prononcé des fibres de la queue au cours du processus d'infection. De plus, nous avons testé l'infectivité de ϕKp24 à l'aide d'une collection de sérotypes K de souches de K. pneumoniae, montrant le panel inhabituellement large de types de CPS ciblés par les fibres de la queue.

La prédiction de la séquence d'acides aminés et les essais de liaison contre une bibliothèque de sérotypes de Klebsiella en combinaison avec une analyse structure-fonction des fibres de la queue ont fourni des informations sur leur organisation complexe hyperramifiée. La combinaison de techniques structurelles, informatiques et de laboratoire nous a permis d'acquérir une connaissance approfondie de la structure et de la fonction de ce bactériophage distinct.

Pour étudier la structure de la capside ϕKp24, nous avons imagé le phage à l'aide de cryo-EM (Fig. 1a supplémentaire, paramètres de collecte de données dans le tableau supplémentaire. 1). Dans notre ensemble de données, nous trouvons trois variantes de la capside : des capsides pleines remplies d'ADN, des capsides vides et des capsides partiellement remplies d'ADN. Nous avons reconstruit les structures de capside complètes (EMD-14356, Fig. 1b supplémentaire, cyan) et vides (EMD-13862, Fig. 1a) de ϕKp24 avec Relion13 à une résolution de 4,3 Å et 4,1 Å après polissage et correction de la sphère d'Ewald, respectivement, en utilisant le critère "gold-standard" FSC0.14314 (Fig. 2b, c supplémentaires). Étant donné que les reconstructions vide et pleine capside se superposent bien (Fig. 1d supplémentaire), nous avons concentré notre analyse sur la reconstruction à plus haute résolution de la capside vide (4, 1 Å). La capside vide (Fig. 1a) a un diamètre de 145 nm de vertex à vertex, 130 nm le long du double axe de symétrie, et suit un T = 27 (h = 3 ; k = 3 ; T = h2 + k2 + hk) symétrie de triangulation avec un contour plan. (Fig. 1b).

a La capside vide d'ADNdb (EMD-13862) du phage ϕKp24 a été reconstruite à une résolution de 4, 1 Å en utilisant 19 193 particules. La structure affichée est colorée radialement en fonction de la distance par rapport au centre de la capside à l'aide de la barre de couleur en bas à droite. b Schéma illustrant l'organisation de la capside ϕKp24. La capside suit une symétrie T = 27. Les volumes h et k dans le calcul de la symétrie de triangulation sont surlignés en rouge (https://viralzone.expasy.org/8577). c Organisation d'un hexamère. Un hexamère peut interagir avec d'autres hexamères ou un pentamère via les bras (bleu) ou les mains (orange) qui ont probablement une fonction stabilisatrice similaire aux protéines de décoration présentes dans d'autres structures de phage. d Diagramme en ruban de gp372 du phage ϕKp24 généré par AlphaFold2. Le modèle se compose de trois parties colorées correspondant au monomère d'un hexamère en c. Le panneau de droite montre gp372 intégré à la carte de densité. e Vue de dessus d'un capsomère hexamérique. Les six monomères sont colorés individuellement. Au centre de l'hexamère, un pore est formé de six longues boucles C-terminales se tordant ensemble (boîte rectangulaire agrandie, panneau supérieur droit). Le panneau inférieur droit montre le pore après rotation de l'image supérieure de 90°. f Deux hexamères avec des interactions inter-capsomères mises en évidence. Deux régions de main gp372 interagissent les unes avec les autres via un grand groupe de résidus chargés, y compris E201, K210, K247, D249, E251, D260 et R264 (boîte rectangulaire agrandie, panneau supérieur). Les corps triangulaires MCP au sein du même hexamère interagissent en utilisant des ponts salins complémentaires entre les résidus R477 et E442 du voisin dans le sens des aiguilles d'une montre, et les résidus R583 et D419 et D587 du voisin dans le sens des aiguilles d'une montre (boîte rectangulaire agrandie, panneau inférieur gauche). Le corps triangulaire interagit également avec la région de la main à travers une série de ponts de sel, y compris K380/E220, E398/R190, R554/E313 et R558/D163 (boîte rectangulaire agrandie, panneau inférieur droit). Les liaisons hydrogène ont été analysées à l'aide de ChimeraX avec des critères de distance et d'angle relâchés (tolérance de 0, 4 Å et 20 °, respectivement). g Vue latérale des interactions hexamère-hexamère après rotation de l'image supérieure de 90°.

La capside du phage Jumbo de Pseudomonas aeruginosa phiKZ15 et des phages de Ralstonia solanacearum ϕRSL116 et ϕRSL217 est construite dans le pli HK9718,19 avec un nombre de triangulation de T = 27. Semblable à ces capsides de phage, la capside de ϕKp24 est construite par un réseau d'hexamères et de pentamères dans chaque facette (Fig. 1b). Les hexamères et pentamères de ϕKp24 sont constitués de copies de la même protéine majeure de capside (MCP, gp372, numéro d'accession QQV92002). La capside contient au total 260 hexamères (vert foncé, 13 par facette) et 11 pentamères (turquoise, un sommet est occupé par le complexe portal), qui représentent 1615 copies du MCP (Supplementary Movie 1). Les MCP sont assemblés dans une coquille icosaédrique qui renferme le génome du phage. Dans le cas de ϕKp24, le MCP prédit est gp372 (Fig. 1d, à gauche).

Gp372 contient 597 acides aminés et est à notre connaissance le plus grand MCP actuellement décrit dans n'importe quel phage. Sa structure a été prédite et modélisée à l'aide d'AlphaFold212 (Fig. 1d, à gauche). Il se compose de trois parties principales : un « corps triangulaire » (Fig. 1c, triangle gris, et Fig. 1d, encadré pointillé, résidus 28–88, 314–597) ; un « bras » (Fig. 1c, ovale bleu, et Fig. 1d, bleu, résidus 89-166) ; et une "main" (Fig. 1c, ovale orange, et Fig. 1d, orange, résidus 167–313).

Alors que le corps triangulaire de MCP gp372 ne montre aucune similitude au niveau de la séquence avec le MCP gp5 du phage HK9720,21, ils présentent une certaine similitude structurelle. Cependant, il existe des différences notables entre le MCP de ϕKp24 et HK97. Gp372 de ϕKp24 contient une longue boucle C-terminale (un composant du pore) qui est absente dans HK97. De plus, les domaines N-terminal et C-terminal sont pliés différemment : (1) le domaine A du monomère gp5 de HK97 a quatre feuillets β centraux, principalement antiparallèles, et deux hélices20. En revanche, il existe cinq feuillets β anti-parallèles et quatre hélices de longueurs différentes dans le domaine correspondant de gp372 (domaine C-terminal); (2) le bras N-terminal du monomère gp5 HK97 est dans une conformation essentiellement non structurée, tandis que le N-terminal de gp372 se replie en une longue hélice (Figs. 5, 6 supplémentaires). Le bras se compose de deux courts feuillets β antiparallèles, de trois courtes hélices et d'un court feuillet β près de la "main". La caractéristique la plus importante de la main est constituée de deux couches de feuilles β, chaque couche contenant trois feuilles β antiparallèles. De plus, il y a deux courtes hélices au bout de la "main".

Pour affiner davantage la structure gp372 en fonction de nos données cryo-EM 3D et pour déterminer les interactions putatives entre les MCP dans l'assemblage de capside natif, nous avons ensuite reconstruit des modèles des assemblages d'hexamère et de pentamère de capside, y compris les hexamères voisins les plus proches (Fig. 9 supplémentaire) comme décrit en détail dans la section Méthodes. En bref, les modèles des assemblages d'hexamères et de pentamères ont d'abord été construits via un amarrage rigide de la structure gp372 prédite, puis affinés à notre carte de 4, 1 Å à l'aide d'un ajustement flexible de dynamique moléculaire (MDFF)22. Le modèle hexamère résultant a ensuite été ancré de manière rigide aux régions correspondantes entourant les assemblages pentamères et hexamères raffinés, et les structures combinées ont été soumises à une simulation MDFF supplémentaire. Les modèles obtenus fournissent donc des informations représentatives sur chaque interaction MCP-MCP unique au sein de la capside, permettant une évaluation des principales interactions résidus-résidus probablement cruciales pour la stabilité de la capside.

Après avoir analysé les contacts inter-MCP de l'hexamère, nous avons rassemblé une liste d'interactions fortes putatives (Fig. 9 supplémentaire). Le corps triangulaire des MCP interagit principalement avec les corps triangulaires des MCP directement adjacents et dans le même hexamère (Fig. 1f). Ces interactions comprennent une série de ponts salins complémentaires entre le résidu R477 et E442 sur le voisin dans le sens des aiguilles d'une montre, ainsi que le résidu R583 et à la fois D419 et D587 sur le voisin dans le sens des aiguilles d'une montre. Le corps triangulaire interagit également fortement avec la région de la main de son voisin dans le sens des aiguilles d'une montre à travers une série de ponts de sel (Fig. 1f), y compris K380/E220, E398/R190, R554/E313 et R558/D163. En plus de ces interactions formées entre les MCP au sein du même hexamère, la région de la main induit également de fortes interactions avec la région de la main d'un MCP d'un hexamère adjacent (Fig. 1f). Ceux-ci impliquent un grand groupe de résidus chargés, y compris E201, K210, K247, D249, E251, D260 et R264, qui forment des interactions complémentaires. Les conformations globales des hexamères centraux et environnants sont assez similaires, affichant un déplacement carré moyen de la racine du squelette (RMSD) d'environ 1,5 Å. Enfin, par rapport à d'autres structures de capside de phage connues23,24, le MCP de ϕKp24 présentait une caractéristique structurelle qui, à notre connaissance, n'avait pas été rapportée auparavant : chacune des six longues boucles C-terminales (résidus Q582-S597) participe à la formation d'un pore hélicoïdal central d'un diamètre extérieur d'environ 2 nm (Fig. 1e, panneaux supérieur et inférieur droit). L'analyse de l'électrostatique le long du pore (Fig. 10 supplémentaire) montre que près de l'entrée (de l'extérieur vers la capside interne), il est hydrophile, tandis que du côté opposé, il est lipophile. De plus, près du centre des pores, il contient une section annulaire chargée négativement.

Chaque pentamère est constitué de cinq monomères MCP (Fig. 2a). En comparaison avec un gp372 dans un hexamère, le N-terminal dans le gp372 du pentamère montre une direction de pliage différente (Fig. 2b, panneau de gauche). De plus, gp372 dans un pentamère modifie l'orientation relative du corps triangulaire et de la main par rapport au MCP dans un hexagone, ce qui rend gp372 plus incurvé dans un pentamère. (Fig. 2b, panneau de droite). La comparaison des hexamères entourant le pentamère avec ceux de l'assemblage hexamétrique montre qu'ils sont également légèrement plus courbés et affichent un RMSD de 3–5 Å.

a Vue de dessus d'un capsomère pentamérique. Cinq structures gp372 ont été insérées dans la carte de densité et colorées différemment. Comparé à l'hexamère, le pentamère n'a pas de pore structuré au centre. Chaque boucle C-terminale est flexible et a tendance à se déplacer vers la zone la plus proche de la main d'un autre gp372. b Comparaison structurelle entre le MCP (cyan) dans un hexamère et le MCP (gris) dans un pentamère. Il existe quelques différences, telles que la boucle C-terminale, l'hélice α N-terminale et l'angle de pendule (flèche rouge supérieure) de deux corps triangulaires (main et bras alignés), ou l'angle de pendule (flèche rouge inférieure) de deux mains (corps triangulaire aligné). L'image de droite en b montre la comparaison après rotation de la structure de gauche de 90°. c Interactions pentamère-hexamère. Les interactions entre un pentamère (gris) et un hexamère voisin (cyan) sont similaires aux interactions entre deux hexamères. Le panneau supérieur gauche montre que la main (grise) du voisin dans le sens des aiguilles d'une montre (CW) peut interagir avec le corps triangulaire (violet) dans le même pentamère en utilisant des ponts salins (résidus E220 et K380, E163 et R558). Dans le MCP pentamère, les résidus R501 et R583 dans le corps triangulaire interagissent avec les résidus D448 et E442 (la boîte rectangulaire agrandie, panneau supérieur droit). Le gp372 d'un hexamère et le gp372 d'un pentamère sont mis en évidence par des couleurs différentes selon les unités structurales. Le corps, le bras et la main triangulaires du gp372 en hexamère sont de couleur noire, bleu foncé et orange. Le corps triangulaire, le bras et la main du gp372 en pentamère sont de couleur violet, vert et rose. d Vue latérale des interactions pentamère-hexamère après rotation de l'image supérieure de 90°.

Dans l'ensemble, les régions d'interaction MCP dans un pentamère sont similaires à celles observées dans l'hexamère (Fig. 1f, Fig. 9 supplémentaire). Cependant, la courbure accrue du pentamère (Figs. 1g, 2d) modifie l'orientation relative entre les régions triangulaires du corps et de la main, conduisant à des contacts de stabilisation différentiels. Plus précisément, dans le pentamère MCP, les résidus R501 et R583 dans le corps triangulaire interagissent avec les résidus D448 et E442, respectivement, dans le corps triangulaire du voisin dans le sens des aiguilles d'une montre. Les interactions avec la région de la main dans le sens des aiguilles d'une montre sont globalement réduites, impliquant les résidus K380 et R558 interagissant avec les résidus E220 et D163, respectivement. De plus, comme on le voit dans l'hexamère MCP, la région de la main dans le pentamère MCP joue un rôle analogue dans la médiation des interactions main-main avec un hexamère voisin à travers un patch chargé de résidus décrit ci-dessus. Contrairement à l'arrangement hexamère, les boucles C-terminales dans le pentamère ne semblent pas former un grand pore bien défini dans la carte de densité. Au lieu de cela, ils sont désordonnés, peut-être en raison de cette disposition différente de l'espace réduit et de l'encombrement stérique plus important entre les MCP dans cette région (Fig. 2a). Néanmoins, nous observons une petite ouverture au centre du pentamère qui peut être capable de transporter du solvant.

Pour la reconstruction hélicoïdale de la queue, des segments de 450 pixels de phages contenant des capsides complètes ont été prélevés. Après classification, polissage et raffinement 3D, la structure de la queue (EMD-14357, Fig. 3a) dans sa conformation étendue a été déterminée à une résolution de 3, 0 Å dans Relion13 (Fig. 11b supplémentaire). La longueur de la queue allongée est de 180 nm en moyenne (mesurée sur des micrographies 2D, du collier à la pointe de la pointe). Sur la base de la carte de densité, le diamètre de la queue est de 24, 5 nm et la longueur du monomère de gaine sur l'axe le plus long est de 11 nm (Fig. 3a). Comme d'autres systèmes d'éjection contractile décrits et des queues de bactériophage, la gaine de queue contractile de ϕKp24 est assemblée autour du tube interne. La gaine et le tube intérieur suivent la même symétrie hélicoïdale avec une symétrie 6 fois supplémentaire autour de l'axe de la queue. L'épaisseur d'un cycle hexamère est de 4 nm. En utilisant HI3D25, la montée et la torsion hélicoïdales sont déterminées à 39,03 Å et 20,89°, respectivement.

a Orientations vue de dessus (image du haut) et vue de côté (image du bas) de la structure 3D (EMD-14357) de la queue hélicoïdale de 3,0 Å. Chacun des six brins hélicoïdaux est coloré différemment. b Modèle de protéine de gaine de queue gp118 générée à partir d'Alphafold2. La protéine de gaine gp118 et la protéine du tube interne gp119 ont été insérées dans un anneau de la carte ϕKp24 EM (image supérieure, vue de dessus ; image inférieure, vue de côté). Dans le panneau inférieur, le monomère de gaine (bleu) qui provient de la couche inférieure est montré pour permettre la visualisation des interactions anneau-anneau. Les contacts entre trois monomères de gaine sont mis en évidence à partir de deux anneaux successifs (la boîte rectangulaire agrandie, panneau inférieur droit). c Diagramme en ruban du modèle AlphaFold2 prédit du monomère de gaine ϕKp24, gp118. Le modèle se compose de deux parties : la gaine centrale (boîte pointillée, orange et bleu foncé) et un composant de gaine externe étendu (bleu clair). L'image inférieure est tournée de 90° par rapport à l'image supérieure pour montrer l'extension N-terminale. d Schéma de l'organisation de la gaine ϕKp24. La crête, où les trois monomères de gaine de deux couches interagissent, est représentée dans un cercle.

La structure de la protéine de la gaine (gp118, numéro d'accession QQV92013.1) a été prédite à l'aide d'AlphaFold2 et ajustée dans la carte EM de la queue ϕKp24 à l'aide d'ISOLDE26 dans ChimeraX27 (Fig. 3b). La protéine de gaine pleine longueur est composée de composants de gaine externe et centrale. Le composant de gaine externe (Fig. 3c, bleu clair) est situé à l'extrémité du monomère de gaine, pointant vers l'extérieur. L'analyse de séquence par ENDscript328 montre que le composant de la gaine externe est un homologue de la protéine de gaine de queue gp29PR (PDB ID: 3SPE) du bactériophage phiKZ (Fig. 15 supplémentaire). Ce composant de la gaine externe n'intervient pas dans les interactions entre les sous-unités lors de l'assemblage29. Dans la conformation contractée, les composants de gaine externe de deux couches peuvent interagir les uns avec les autres par des forces électrostatiques. Cela est probablement dû au fait que les surfaces orientées vers le haut des composants de la gaine externe contiennent un patch chargé négativement, tandis que les surfaces orientées vers le bas affichent un patch chargé positivement (Fig. 18 supplémentaire).

Le composant central de la gaine (Fig. 3c, orange et bleu foncé) se compose du domaine C-terminal, du domaine N-terminal et de deux longues extensions. La gaine centrale est essentielle dans l'assemblage et la contraction de la gaine. Pour faciliter les interactions entre les protéines de la gaine de la queue dans la queue, les deux longues extensions de la gaine centrale (l'extension N-terminale, résidus M1—S21 ; l'extension C-terminale, résidus A667—G689) peuvent se connecter au C-terminal domaines de deux protéines gp118 adjacentes situées dans l'anneau ci-dessous (Fig. 3d). De plus, le domaine C-terminal peut se connecter à deux protéines de gaine adjacentes situées dans l'anneau supérieur (Fig. 3b, panneau inférieur droit). Ainsi, trois protéines de gaine de deux couches différentes se lient au sein d'une crête dite (Fig. 3d). Les composants de la gaine centrale ne peuvent pas interagir les uns avec les autres au sein d'un anneau dans la même couche, et toutes les interactions entre les anneaux sont confinées aux crêtes (Fig. 3a, d). Les structures atomiques montrent que les extensions de gaine peuvent créer un « maillage » (Fig. 3d).

Le tube d'autres systèmes d'injection contractile, tels que le phage T430, les pyocines de type R31, le prophage antifeeding de Serratia entomophila (afp)32 et le système de sécrétion bactérienne de type VI (T6SS)33,34, montrent la capacité de translocation de différents substrats et le la nature du substrat détermine les propriétés du canal du tube30. Le tube du phage ϕKp24 montre une fonction similaire.

La structure de la protéine tubulaire (gp119, numéro d'accession QQV92088.1, Fig. 4a) a été prédite à l'aide d'AlphaFold2 et ajustée de manière flexible dans la carte EM de la queue ϕKp24. Nous avons utilisé gp119 pour construire un modèle du tube du phage ϕKp24. Une structure en forme d'anneau constituée de six protéines tubulaires représente une unité d'assemblage du tube interne du phage ϕKp24 (Fig. 4b, c). Il y a deux caractéristiques les plus importantes de gp119 : (1) la longue extension C-terminale peut atteindre une autre gp119 située dans la couche directement au-dessus (vers la capside) ; (2) le domaine N-terminal peut s'étendre à une gp119 voisine dans un même disque (Fig. 4b). Comparé au monomère gp19 de la protéine tube du phage T4 (PDB: 5W5F), gp119 ne montre aucune similarité de séquence mais un repliement similaire à son noyau (gp19 a une extension C-terminale plus courte et un domaine N-terminal plus petit) (Fig. 21a supplémentaire) . gp119 et gp19 ont en commun deux couches de feuillets β. De plus, deux longues feuilles anti-β peuvent s'étendre jusqu'à la protéine-tube voisine dans le même disque. (Fig. 21 supplémentaire). La surface interne du tube affiche une charge négative proéminente (Fig. 4d), qui empêche l'ADN du phage chargé négativement de coller à la surface.

un diagramme en ruban du modèle AlphaFold2 prédit du monomère de protéine tube gp119 de ϕKp24, de couleur arc-en-ciel dans ChimeraX. b Diagramme en ruban de deux disques (hexamères) dans le tube du phage ϕKp24, une gp119 typique a été représentée en couleur arc-en-ciel. c Vue en coupe sous forme de diagramme en ruban de la structure du tube (trois disques). d diagrammes électrostatiques montrant la surface interne de la structure du tube en c. Répartition des charges : rouge = négatif ; bleu = positif ; blanc = neutre. Le potentiel électrostatique a été coloré dans ChimeraX. e Vues latérales de l'interface entre une partie de la protéine de la gaine (domaine C-terminal de la gaine centrale) et quatre sous-unités de la protéine tube. Le résidu R623 de gp118 peut interagir avec le résidu D268 de gp119 en utilisant un pont de sel (la boîte rectangulaire agrandie, en haut à gauche). f La surface chargée de e. g Une vue à livre ouvert de f. Les patchs complémentaires de charges en interaction sur la gaine et le tube sont marqués d'ovales.

Les interactions gaine-tube peuvent provenir de forces électrostatiques et non covalentes et de la viscosité dans l'espace à l'échelle nanométrique (eau interstitielle) entre le tube de queue et la gaine environnante35. Les forces électrostatiques sont largement perpendiculaires à l'axe du tube de queue et contribuent ainsi à la liaison entre la gaine et le tube de queue. Pour le phage ϕKp24, la gaine interagit via des liaisons hydrogène avec le tube interne : le résidu R623 de la protéine de gaine gp118 peut interagir avec le résidu D268 de la protéine de tube gp119 via un pont salin (Fig. 4e). De plus, la protéine de gaine gp118 se connecte aux sous-unités du tube interne en utilisant une interaction électrostatique (Fig. 4g). La surface extérieure des sous-unités de tube affiche un patch chargé positif (Fig. 4g, panneau de droite). Le domaine C-terminal de la protéine de gaine se lie au patch du tube via un patch complémentaire chargé négativement sur l'une de ses deux hélices α.

Le tube de queue est connu pour avoir un rôle critique dans l'assemblage de la gaine à l'état étendu des queues de phage36. Semblable à d'autres systèmes de queue de phage, nous proposons que l'assemblage de la gaine de ϕKp24 commence à partir de la plaque de base, comme c'est le cas pour le phage T437. Le tube et la plaque de base peuvent former une "plate-forme" à laquelle le premier disque de sous-unités de gaine se lie. Par la suite, le tube et le disque des sous-unités de gaine allongées servent d'échafaudage pour l'assemblage du reste de la gaine. Ainsi, l'assemblage de l'état contracté est évité par la création d'un gabarit dans lequel les sous-unités de gaine interagissent le long de la crête sans aucun contact latéral (Fig. 3d). Cet assemblage piloté par un modèle aboutit probablement à une structure oligomère métastable, qui pourrait être déverrouillée par la plaque de base pour la contraction de la queue lors de l'interaction avec la surface de la cellule cible.

Pour étudier les structures et les changements conformationnels des fibres de la queue lors de la fixation cellulaire et de l'injection du génome, nous avons utilisé la cryo-ET. Nous avons imagé ϕKp24 avec son hôte K. pneumoniae et observé des phages intacts dans quatre états différents : particules libres avec et sans ADN, et particules adsorbées avec et sans ADN. Ces quatre états correspondent à quatre états différents au cours de l'infection par le phage : phage libre, phages à infection précoce attachés à l'hôte, phages post-infection (vides) encore attachés à la cellule et phages libres post-infection (vides). Une image cryo-ET 2D représentative (Fig. 5a) montre plusieurs de ces états. Pour trouver les architectures des fibres désordonnées à différents moments du processus d'infection, nous nous sommes concentrés sur ϕKp24 intact attaché à une cellule de K. pneumoniae. Nous avons sélectionné et extrait des phages intacts à partir de 89 reconstructions 3D débruitées dans IMOD38.

une image cryo-ET 2D montrant plusieurs états différents du phage ϕKp24 dans son environnement natif : phages libres (phages à capsides foncées, flèche bleue), phages à infection précoce (phages à capsides foncées et attachés à la membrane de l'hôte, flèche noire), milieu - les phages d'infection (phages avec des capsides semi-sombres et attachés à la membrane de l'hôte, flèche verte), et les phages post-infection (vides) encore attachés à la cellule (flèche blanche). b Tomogrammes découpés du phage ϕKp24 et segmentations manuelles. La première colonne montre sept tomogrammes représentatifs de ϕKp24 dans différents états lors de l'injection. De haut en bas, le premier tomogramme montre un phage libre (capside pleine), les deuxième à quatrième tomogrammes montrent des phages d'infection précoce (capsides pleines) attachés à une cellule, et les cinquième à septième tomogrammes montrent des phages post-infectieux (capsides vides). capsides) attachées à l'hôte. La deuxième colonne montre sept segmentations manuelles des fibres de la queue correspondant aux tomogrammes présentés à gauche. La gaine est colorée en violet, les fibres sont colorées en cyan et le tube est coloré en jaune. La troisième colonne montre la vue latérale de chaque segmentation gauche après rotation de 90°.

En raison de la grande complexité et de la nature hétérogène des fibres de queue, nous avons choisi de segmenter manuellement les fibres de queue à l'aide de la fonction de segmentation IMOD38. Nous avons d'abord extrait des sous-volumes de phages individuels de l'ensemble des tomographies (Fig. 5b). Ici, nous avons cherché à sélectionner des phages qui se trouvaient à différents stades d'infection, de l'état pré- à l'état post-infection. Nous avons ensuite segmenté les queues de phage de ces phages (Fig. 5b) et comparé leur architecture globale. Nous avons constaté que les fibres du phage pré-infectieux sont disposées autour de la plaque de base dans une organisation quasi sphérique. En revanche, lorsque les phages se fixent à une cellule hôte, les fibres interagissent avec les sites de liaison sur l'enveloppe cellulaire, modifiant l'architecture globale. Les fibres de queue s'arrangent le long de la surface de la cellule, créant une "plaque de queue" plate. De plus, on observe que la queue des phages attachés n'est pas disposée verticalement par rapport à l'enveloppe cellulaire. Au lieu de cela, il est incliné, bien que cela puisse être un artefact de la préparation de l'échantillon, il est également possible que l'injection du génome se produise sous un angle dans certains cas.

En raison de la longue segmentation manuelle des fibres de la queue, nous avons construit un réseau de neurones39 pour détecter automatiquement les fibres de la queue du phage ϕKp24 dans les tomographies reconstruites. Nous avons formé le réseau en utilisant les segmentations manuelles des fibres de queue et, après plusieurs cycles d'optimisation, nous avons appliqué le réseau formé à tous les tomogrammes, générant des cartes 3D contenant des structures de fibres de queue. Nous définissons les phages de pré-infection comme suit : (1) la capside est pleine, (2) la queue est allongée, (3) le phage est intact et (4) le phage n'est pas en contact avec une cellule bactérienne. De même, nous définissons les phages post-infection comme suit : (1) la capside est vide, (2) la queue est contractée et (3) il existe quelques connexions entre les extrémités des fibres et la membrane cellulaire. Après extraction et conversion de format, 89 structures de fibres de queue de phage pré-infection et 338 structures de fibres de queue de phage attaché post-infection ont été générées. 40 structures représentatives de fibres de queue de pré-infection et de structures de fibres de queue de post-infection sont sélectionnées par inspection visuelle et illustrées dans les Figs supplémentaires. 24, 25. Ces structures 3D montrent clairement que chaque structure de fibre de queue est dans une conformation différente. Dans le groupe de phages pré-infection (Fig. 24 supplémentaire), les fibres de la queue sont disposées autour de la plaque de base dans un arrangement quasi sphérique. La gamme de taille des structures de fibres de queue est d'environ 110 à 130 nm de hauteur, 150 à 170 nm de longueur et 90 à 130 nm d'épaisseur. Dans le groupe de phages post-injection (Fig. 25 supplémentaire), la plupart des structures de fibres de queue sont disposées dans une configuration ovale en forme de disque. La plage de taille en 3D est de 120 à 150 nm de hauteur, de 160 à 190 nm de longueur et de 60 à 100 nm d'épaisseur.

Pour révéler davantage les changements conformationnels des fibres de la queue aux stades de pré-infection et de post-infection, les cartes de chaque groupe ont été alignées les unes par rapport aux autres et moyennées pour produire des formes de fibres «canoniques». Enfin, nous avons obtenu les structures superposées en 3D des fibres de la queue en pré-infection (Fig. 6a) et en post-infection (Fig. 6b), qui montrent clairement un changement conformationnel de la fibre de la queue d'une forme presque sphérique à un disque plat. Entre ces configurations, l'épaisseur change d'environ 40 nm. De plus, la queue de la structure superposée post-infection n'est pas perpendiculaire au disque des fibres, ce qui suggère que la queue n'est pas orientée perpendiculairement à la surface de l'hôte lors de l'injection d'ADN. Ceci est également apparent dans les structures individuelles des fibres de la queue et des segmentations manuelles. Nous avons réalisé une animation illustrant l'attachement du phage ϕKp24, le réarrangement des fibres de la queue et l'éjection de l'ADN (Supplémentaire Film 2).

une structure superposée en 3D des fibres de queue dans les phages de pré-infection. 89 structures de fibres de queue de phages de pré-infection ont été alignées et moyennées. L'image de droite montre la vue latérale de la structure après rotation de 90°. La boîte extérieure et la ligne rouge sont des barres d'échelle avec une unité de pixel. La taille de la boîte carrée extérieure est de 200 pixels, la taille des pixels est de 1,312 nm. La taille de la structure des fibres de queue est d'environ 137,8 nm de longueur, 78,7 nm de hauteur et 104,9 nm d'épaisseur. b Structure superposée en 3D des fibres de la queue dans les phages post-infection. 338 structures de fibres de queue de phages post-infection attachées à l'hôte ont été alignées et moyennées. La structure des fibres de la queue ressemble à un disque aplati. La taille est de 177,1 nm de longueur, 118,1 nm de hauteur et 65,6 nm d'épaisseur. c Diagramme schématique de la gaine du phage (violet), du tube interne (jaune) et de la structure des fibres de la queue (cyan). Ici, nous avons défini la hauteur, la longueur et l'épaisseur de la structure.

Une collection de souches avec 77 sérotypes capsulaires différents (type K) a été utilisée pour caractériser l'infectivité de ϕKp24. Cette analyse a révélé neuf souches représentatives des sérotypes (K2, K13, K19, K25, K35, K46, K61, K64 et K81) sensibles à ϕKp24 avec une efficacité de placage allant de 1 à 0,001 par rapport à la souche hôte ϕKp24 (Fig. 26 et données supplémentaires 1). Cependant, la similarité de séquence40 et la modélisation d'homologie basée sur la structure suggèrent que le phage porte quatorze protéines de fibre de queue (gp168, gp196, gp294, gp295, gp300, gp301, gp303, gp304, gp306, gp307, gp308, gp309, gp310 et gp313 ; Tableau 1) au lieu des neuf prédits précédemment11. Ces protéines possèdent une activité de dépolymérisation putative (lyase ou hydrolase) et un pli β-hélicoïdal, qui est une caractéristique caractéristique des dépolymérases du phage Klebsiella. Pour cinq d'entre eux, un sérotype K putatif peut être prédit sur la base de la similarité de la séquence d'acides aminés avec les dépolymérases vérifiées expérimentalement (tableau 1). La modélisation des quatorze protéines avec RoseTTAFold42 a révélé une forme saillante allongée typique composée de brins β parallèles orthogonaux à l'axe long (Fig. 7, Données supplémentaires 2).

a La délimitation schématique des différents modules dans 14 fibres de queue prédites aboutit à quatre groupes (G1, G2, G3 et G4) en fonction de la longueur de leurs modules structurels. Notez que les orientations relatives des domaines individuels dans la structure prédite peuvent être différentes de celles représentées. b Quatorze structures de fibres de queue prédites. Les fibres de queue à activité dépolymérase sont généralement composées de modules structurels responsables de la fixation et de la ramification de la queue (bleu), d'une hélice α séparatrice (verte) et d'une hélice β à activité enzymatique (jaune). c Un modèle d'hyperramification des fibres de queue de ϕKp24.

Les phages du groupe Menlow8 (KpS110 et 0507-KN2-1) et le phage ΦK64-1 groupe6 (ΦK64-1 et RaK2) sont les phages Klebsiella avec l'appareil à fibres de queue le plus élaboré décrit jusqu'à présent, comprenant entre cinq et onze fibres de queue . L'extrémité N-terminale (Fig. 7, éléments bleus) des fibres de queue de phage de Klebsiella a généralement un rôle structurel impliqué soit dans la fixation aux queues de phage ou à une autre fibre de queue, soit dans la fourniture d'un site d'amarrage pour d'autres fibres de queue8. L'extrémité C-terminale (Fig. 7, éléments jaunes) contient le domaine enzymatique de la dépolymérase définissant la spécificité du sérotype de la capsule et présente un pli β-hélicoïdal. L'extrémité C-terminale peut également comprendre des chaperons supplémentaires ou des domaines de liaison aux glucides43,44,45,46,47. Les terminaisons N et C sont généralement séparées par une hélice α48 (Fig. 7, éléments verts). Les quatorze dépolymérases putatives de ϕKp24 ont été divisées en quatre groupes (G1-G4) en fonction de la longueur de la partie structurelle N-terminale. La partie N-terminale la plus longue de gp306 indique que gp306 (G1) est la fibre de queue primaire. Dans notre modèle (Fig. 7c), son grand domaine structurel N-terminal attache le système complet de fibres de queue hyperramifiées à la plaque de base et sert de site d'amarrage pour les fibres de queue secondaires (système de ramification) via des domaines spécifiques de type T4gp10. Ces domaines ont été précédemment confirmés expérimentalement dans les systèmes de fibres de queue ramifiées des phages G7C49 et CBA12050. Les fibres de queue secondaires peuvent comprendre des sites d'amarrage supplémentaires pour les fibres de queue tertiaires comme décrit pour les phages appartenant aux phages du groupe Menlow8. Ainsi, les quatre groupes différents correspondent à des positions plus périphériques dans l'arrangement des fibres de queue. L'analyse HHPred51 (données supplémentaires 2) a détecté dans gp306 (G1) et gp301 (G2) la présence d'un long pli de type T4gp10 comprenant des sites d'amarrage pour plus d'une fibre de queue. Le groupe 3 (G3) contient neuf protéines (gp168, gp196, gp300, gp303, gp304, gp307, gp308, gp309 et gp310) avec une structure N-terminale plus courte mais suffisante pour héberger un domaine responsable de l'attachement à un site d'amarrage. Une seule fibre de queue avec une activité de dépolymérase prédite possède un court peptide N-terminal (51 aa) précédant l'hélice a de séparation, c'est-à-dire gp313 (G4). Ce peptide pourrait médier l'attachement à une autre fibre de queue. Au total, l'architecture de la fibre de queue de ϕKp24 semble être organisée en couches périphériques hyperramifiées avec gp306 agissant comme la fibre de queue primaire

Le problème croissant de la résistance aux antibiotiques chez les pathogènes bactériens a suscité un regain d'intérêt pour l'utilisation des phages pour traiter les infections bactériennes résistantes aux antibiotiques. Pour une utilisation optimale des phages dans des applications thérapeutiques, nous devons améliorer notre compréhension de leur structure et de leur fonction. Le phage Klebsiella ϕKp24 récemment décrit est un phage candidat prometteur avec une gamme d'hôtes élargie, infectant au moins neuf types capsulaires différents et probablement encore plus sur la base des quatorze fibres de queue prédites avec une activité dépolymérase.

Démêler la morphologie unique représente un défi pour les études structurelles détaillées. En particulier, la grande taille de la capside et la nature hétérogène des fibres de la queue posent un défi pour la collecte et l'analyse des données. Ils nécessitent la combinaison de différentes méthodes structurelles pour résoudre la structure globale. Les algorithmes de prédiction de la structure des protéines, tels que AlphaFold2 et RoseTTAFold sont devenus des outils inestimables pour l'élucidation de la structure macromoléculaire à base de cryo-EM. De plus, l'apprentissage automatique offre une nouvelle façon d'analyser les données d'image complexes de cryo-ET. Dans cette étude, nous avons combiné l'analyse de particules uniques et la tomographie cryo-électronique avec la prédiction de la structure des protéines, les simulations moléculaires et l'apprentissage automatique. Cela nous a permis de découvrir la structure de la particule ϕKp24, ainsi que les changements morphologiques caractéristiques subis par le phage lors de l'infection de l'hôte.

La grande taille de la capside, en particulier, ainsi qu'une grande quantité de données posent également des problèmes de calcul lors du traitement des données. Plus précisément, le diamètre de la capside de ϕKp24 est d'environ 1450 Å. Selon le gradient décroissant de la courbe FSC dans Relion, l'ensemble de données utilisé pour le raffinement 3D final a dû être regroupé de 1,5 × pour équilibrer la résolution finale avec les ressources de calcul disponibles. La capside vide a été reconstruite à une résolution de 4,1 Å, qui est la résolution la plus élevée que nous puissions attendre des particules en raison de la taille des pixels (2,055 Å). La capside vide de ϕKp24 est actuellement la capside de résolution la plus élevée de tous les phages jumbo déposés dans l'EMDB (Electron Microscopy Data Bank).

Le principal composant structurel de la capside est le MCP gp372. Cette protéine inhabituellement grande est à la base des hexamères et des pentamères qui forment la capside. En règle générale, les capsides de phage sont composées d'un (ou deux) MCP et de protéines de décoration (protéines externes supplémentaires qui relient les MCP ensemble). Notre reconstruction de la capside de ϕKp24 a montré que la totalité de la capside de ϕKp24 peut être assemblée par un seul MCP seul.

Dans les hexamères, les six longues boucles C-terminales forment un pore au centre d'un hexamère. À notre connaissance, un pore similaire n'a pas été signalé auparavant dans d'autres capsides de phages. La fonction exacte de ce pore est actuellement incertaine. Cependant, des pores ont été signalés dans des virus, par exemple dans le VIH-1. Ce virion utilise des pores de capside dynamiques pour importer des nucléotides et alimenter la synthèse d'ADN encapsulé52. Nous supposons que le pore de ϕKp24 peut être impliqué dans l'équilibrage des différences de pression lors du chargement de l'ADN dans la capside, ou lors de l'éjection de l'ADN lorsque la taille de la capside augmente.

Il existe un lien évolutif émergeant entre certaines protéines de queue de phage et le système de sécrétion bactérien Gram négatif de type VI (T6SS) qui est impliqué dans divers processus liés à la virulence53,54,55. La structure de la gaine contractile rapportée ici montre de fortes similitudes avec d'autres systèmes contractiles, tels que la pyocine de type R31 et T430. Ceci suggère que la queue hélicoïdale du phage ϕKp24 fonctionne de manière similaire. En outre, la structure résolue ici suggère que les extensions de connexion de sous-unité (extension C-terminale) de la protéine de gaine gp118 fonctionnent comme des charnières pendant la contraction, la gaine centrale de gp118 conservant probablement sa structure. Le réarrangement des sous-unités de la gaine lors de la contraction conduit à une structure beaucoup plus dense. Ici, les crêtes se rapprochent pour devenir en partie interdigitées. Dans la queue contractée, les connexions avec le tube interne sont perdues, permettant au tube de s'insérer dans la membrane de la cellule cible pendant l'infection31.

Les tomographies révèlent que les queues des phages attachés n'apparaissent pas verticales par rapport à l'enveloppe cellulaire. Au lieu de cela, les queues des phages avec des capsides pleines ou vides sont inclinées. Bien que nous ne puissions pas exclure que cette observation soit un artefact de la préparation de l'échantillon, cette pièce jointe peut être physiologiquement pertinente. Une queue inclinée peut réduire l'énergie requise pour la contraction et l'éjection de l'ADN, ainsi que les dommages à l'enveloppe cellulaire pour empêcher la lyse prématurée de l'hôte.

Contrairement à la capside et à la queue, les fibres de la queue sont structurellement très hétérogènes et ne se prêtent pas à l'analyse d'une seule particule. En utilisant un réseau de neurones spécialement conçu pour une formation précise avec un nombre limité d'exemples56, nous avons pu former un réseau utilisant les segmentations des fibres de la queue de seulement sept particules de phage, limitant ainsi la segmentation manuelle à forte intensité de main-d'œuvre. Après la formation, l'analyse automatique en réseau des fibres de queue de plus de 600 phages, démontrant les possibilités de l'apprentissage automatique pour faciliter l'analyse de structures complexes.

Les données sur les fibres de queue ont révélé la complexité exquise de ces fibres de queue et un changement significatif dans leur disposition entre les phages libres et ceux liés à une cellule hôte. Alors que les fibres s'arrangent comme une sphère autour de l'extrémité de la queue d'un phage libre, dans les phages liés à l'hôte, les fibres de la queue s'adaptent à l'enveloppe de l'hôte et forment une plaque. Notamment, le changement de conformation des fibres de la queue précède la libération d'ADN. Par conséquent, cela peut faire partie du mécanisme de déclenchement lui-même.

L'analyse de la gamme d'hôtes de ϕKp24 a révélé un nombre sans précédent de sérotypes de capsules ciblés par ce phage. Cette observation correspond aux fibres de queue multiples avec une activité de dépolymérase spécifique prédite dans le génome du grand phage et au système de fibres de queue hautement ramifié qui pourrait être visualisé. L'analyse structurelle des fibres de la queue indique une architecture structurelle étendue pour intégrer toutes les fibres de la queue dans la particule de phage, gp306 émergeant comme le principal candidat de la fibre de la queue en contact direct avec la queue du phage, tandis que les groupes suivants de fibres de la queue ont un domaine structurel de plus en plus raccourci. , faisant allusion à un emplacement plus périphérique.

En résumé, les connaissances acquises grâce à cette nouvelle combinaison de diverses méthodes fournissent une base essentielle pour le développement d'applications cliniques potentielles. Récemment, la phagothérapie a été appliquée avec succès pour traiter une infection causée par une souche de K. pneumoniae pan-résistante aux médicaments13. La gamme d'hôtes étendue de ϕKp24 déterminée ici peut en faire un candidat attractif pour le développement de la phagothérapie.

Les souches de référence de K. pneumoniae utilisées dans cette étude (Données supplémentaires 1) ont été obtenues auprès de la Collection de l'Institut Pasteur (CIP, Paris, France, souches marquées CIP) ou achetées auprès de la Collection nationale de cultures types (souches marquées NCTC) . Les bactéries ont été stockées à -70 ° C dans du Trypticase Soy Broth (TSB, Becton Dickinson and Company, Cockeysville, MD, USA) additionné de 20% de glycérol.

Le phage ϕKp24 (numéro d'accès Genbank MW394391) a été précédemment isolé à partir d'eaux usées11. ϕKp24 a été cultivé dans 2 L de bouillon de lysogénie (LB) en utilisant la souche K. pneumoniae K5962 comme hôte (numéro d'accès Genbank Bioproject PRJNA745534). La culture résultante a été centrifugée (9000 xg, 15 min) et le surnageant contenant le phage a été stérilisé sur filtre. Le lysat de phage a ensuite été lavé avec un tampon SM (100 mM NaCl, 8 mM MgSO4, 50 mM Tris-HCl pH 7,5) et concentré 10 fois à l'aide d'une cassette à flux tangentiel (100 kDa PES Vivaflow 200, Sartorius, Allemagne). Le titre de phage a été déterminé en déposant des dilutions en série de la solution de phage sur des plaques de gélose à double couche de la souche K5962 pour la détection des phages.

La méthode spot a été utilisée pour déterminer la spécificité du sérotype et la production potentielle de capsule ciblant les dépolymérases par le phage ϕKp24. Les analyses ont été réalisées sur la collection de sérotypes de K. pneumoniae (Données supplémentaires 1, 2). Les cultures bactériennes d'une nuit ont été mises en suspension dans du TSB frais, incubées pendant 2 heures à 37 ° C avec agitation (140 tr / min) et ont été versées sur des plaques de Trypticase Soy Agar (TSA, Becton Dickinson and Company, Cockeysville, MD, USA). Après séchage, 10 µL de dilutions en série au 10 du phage ϕKp24 (109 PFU/mL comme concentration de départ) ont été déposés sur des tapis bactériens. Après une nuit d'incubation à 37 °C, les pelouses ont été inspectées pour les zones de plaque et de halo. L'efficacité de l'étalement a été calculée en divisant le titre du phage à la dilution terminale sur la souche test par le titre du même phage sur sa souche hôte.

La séquence génomique du phage ϕKp24 a été obtenue à partir de la base de données GenBank (NCBI Accession No MW394391). Toutes les protéines du phage ϕKp24 ont été analysées avec Phyre241 à la recherche de fibres de queue putatives à activité dépolymérase. Les critères pour la prédiction de l'activité dépolymérase putative étaient comme dans8 avec quelques modifications : (1) la protéine est plus longue que 200 résidus ; (2) la protéine est annotée comme queue/fibre de queue/pointe de queue/protéine hypothétique dans la base de données NCBI ; (3) the protein shows homology to domains annotated as lyase [hyaluronate lyases (hyaluronidases), pectin/pectate lyases, alginate lyases, K5 lyases] or hydrolase (sialidases, rhamnosidases, levanases, dextranases, xylanases, glucosidase, galacturonase, galacturonosidase, glucanase ) avec une confiance d'au moins 40 % dans Phyre2 ; (4) la longueur d'homologie avec l'un de ces domaines enzymatiques doit s'étendre sur au moins 100 résidus ; (5) une structure β-hélicoïdale typique devrait être prédite par Phyre2. Les protéines prédites ont été modélisées avec RoseTTAFold42. Les modèles prédits ont été analysés plus en détail et la dernière hélice α avant la structure en hélice β a été choisie comme point final pour la partie structurelle N-terminale. Les protéines ont été classées selon la longueur de la partie structurelle N-terminale, en commençant par la plus longue. Les protéines ont ensuite été analysées avec BlastP40 et HMMER57. BlastP a été utilisé pour déterminer la spécificité du sérotype sur la base des similitudes de séquence d'acides aminés des dépolymérases trouvées dans la base de données. Les critères suivants ont été déterminés pour l'analyse : (i) la protéine homologue doit avoir une activité de dépolymérase confirmée et une spécificité pour le sérotype particulier de K. pneumoniae, (ii) l'identité de la séquence d'acides aminés doit dépasser 30 %, et (iii) la longueur de l'homologie doit être supérieure à 100 acides aminés. L'extrémité N-terminale de chaque protéine sélectionnée a été analysée avec HHPred51,58 en utilisant un alignement par paires à la recherche de domaines de type T4gp10. Les paramètres par défaut ont été utilisés : Méthode de génération MSA : HHblits = >UniRef30 ; Itérations de génération MSA : 3 ; Seuil de valeur E pour la génération MSA : 1e-3 ; Identité min seq des hits MSA avec requête (%) : 0 ; Couverture minimale des accès MSA (%) : 20 ; Notation de structure secondaire : pendant_alignement ; Mode d'alignement : réaligner avec MAC : local : norealign ; Seuil de réalignement MAC : 0,3 ; Nombre maximal de coups ciblés : 250 ; Probabilité minimale dans la liste de résultats (%) : 20. L'alignement a été effectué par rapport à T4gp10 (NP_049768.1), l'extrémité N-terminale de CBA120gp163 (orf 211, YP_004957865.1), CBA120gp165 (orf 213, YP_004957867.1) et G7Cgp66 (YP_0047 82196 .1).

K. pneumoniae K5962 a été cultivé pendant une nuit à 30 °C sous agitation à 180 tr/min. La culture d'une nuit a été utilisée pour inoculer 10 ml de milieu LB frais et cultivée pendant 2 heures à 30 ° C, 180 tr/min. Par la suite, 1,6 mL de phage ϕKp24 (9 × 1012 PFU/mL) ont été ajoutés à la culture et incubés pendant 80 min supplémentaires. La culture a été contrôlée visuellement pour confirmer la lyse cellulaire, et 200 ul ont été centrifugés (5000 x g, 5 min) et le culot a été remis en suspension dans le même volume de milieu frais. Enfin, 5 µl de billes d'or de 10 nm (Cell Microscopy Core, Université d'Utrecht, Utrecht, Pays-Bas) ont été ajoutés à 50 µl du mélange bactérien-phage préparé. À l'aide du Leica EM GP (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne), 3,8 µl du mélange ont été appliqués sur une grille Quantifoil R2/2 à décharge luminescente, 200 mesh Cu (Quantifoil Micro Tools GmbH, Jena, Allemagne) et incubés 30 s avant le transfert. à 20 °C avec une humidité relative d'environ 95 %. Les grilles bactérien-phage ont été buvardées pendant 1 s et automatiquement plongées dans de l'éthane liquide. Les échantillons vitrifiés ont été transférés dans des boîtes de stockage et stockés dans de l'azote liquide jusqu'à leur utilisation.

ϕKp24 a été concentré comme suit : 1000 µl de liquide de phage ϕKp24 (9 × 1012 PFU/mL) ont été centrifugés à une vitesse inférieure (5 k) pendant 2 à 3 fois (15 min/par tour) jusqu'à ce que le tampon cesse d'éluer d'un concentrateur de protéines (filtre cellulosique 10 kDa). Par la suite, l'échantillon a été immédiatement utilisé pour la congélation en plongée. À l'aide du Leica EM GP, 3,5 µl de phage concentré ont été ajoutés à une grille Cu Quantifoil R2/2 à décharge luminescente, 200 mesh, incubée 10 s à 18 °C avec une humidité relative d'environ 95 %. Les grilles de phages ont été buvardées pendant 0,7 s et automatiquement plongées dans de l'éthane liquide. Les échantillons vitrifiés ont été stockés dans de l'azote liquide jusqu'à leur utilisation.

Les grilles contenant K. pneumoniae K5962 et ϕKp24 ont été clipsées et chargées dans un Titan Krios (Thermo Fisher Scientific (TFS)) équipé d'un détecteur d'électrons direct K3 BioQuantum et d'un filtre énergétique (Gatan, Inc), qui a été réglé sur une imagerie à perte nulle avec une largeur de fente de 20 eV. Les cibles d'imagerie ont été choisies en sélectionnant des cellules bactériennes qui se trouvaient dans un trou du film de carbone de la grille EM. Les bactéries qui semblaient moins denses à faible grossissement indiquaient une infection phagique progressive. Les données ont été collectées sous forme de piles d'images de films à l'aide de SerialEM réglé sur un schéma d'inclinaison à symétrie de dose entre -54° et 54°, avec des incréments d'inclinaison de 2°59,60. Le grossissement nominal sélectionné était de 26 000, ce qui correspond à une taille de pixel de 3,28 Å dans les images collectées. La défocalisation des données collectées variait de -4 à -6 µm. La dose totale estimée par série d'inclinaison était de 100 e/Å2.

Les grilles contenant ϕKp24 ont été coupées et chargées dans un microscope électronique Titan Krios (Thermo Fisher Scientific, TFS) fonctionnant à 300 kV, équipé d'un détecteur d'électrons direct Gatan K3 BioQuantum (Gatan). Les films ont été enregistrés en utilisant EPU (Thermo Fisher Scientific, TFS) et AFIS (décalage d'image sans aberration) en mode super-résolution à un grossissement nominal de 64 000, correspondant à une taille de pixel calibrée de 0,685 Å avec une plage de défocalisation de -1 à -5 µm et une dose totale de 30 e/Å2 (voir les paramètres de collecte de données dans le tableau supplémentaire. 1).

La correction du mouvement, l'alignement du cadre, l'alignement de la série d'inclinaison à l'aide de repères en or et la reconstruction du tomogramme ont été effectués à l'aide d'IMOD38. Les ensembles de données ont été regroupés par un facteur de 2. À partir des tomogrammes reconstruits, des phages ϕKp24 avec des plaques de base clairement visibles et des fibres de queue ont été prélevés pour la segmentation à l'aide d'IMOD. La visualisation des données a été effectuée par l'IMOD et les Fidji61.

La capside du phage ϕKp24 a été reconstruite à l'aide de Relion 3.1.213. MotionCorr62 a été utilisé pour corriger le mouvement des particules induit par le faisceau. La fonction de transfert de contraste a été estimée par CTFFIND 4.1.1863. Initialement, 61 particules de capside ont été sélectionnées manuellement pour la classification 2D afin de générer des modèles de référence pour la sélection automatique. La sélection automatique Relion a ensuite été utilisée pour sélectionner automatiquement 290 280 particules, qui ont été regroupées par 4 pour une classification 2D lors de l'extraction. Après plusieurs cycles de classification 2D, les particules présentant des caractéristiques faussement positives et contaminantes ont été rejetées, ce qui a donné un ensemble de données de 28 090 particules, qui a ensuite été classée en deux classes : les capsides vides et les capsides pleines. Pour équilibrer la résolution finale et la vitesse de calcul, l'ensemble de données a été sous-échantillonné 1,5 × avec une taille de pixel finale de 2,055 Å, une boîte à particules de 800 pixels et un diamètre de masque circulaire de 1600 Å. Les particules extraites ont ensuite été soumises à un modèle initial 3D et à une classification. La classe avec le plus grand nombre de particules a été utilisée pour le raffinement 3D final (cela sépare et supprime les capsides partiellement remplies d'ADN). Enfin, nous avons choisi séparément la classe de capside vide et la classe de capside complète pour le raffinement 3D en utilisant la symétrie icosaédrique I1, et la correction de la sphère d'Ewald utilisant un algorithme de traitement d'image à bande latérale unique64 a été appliquée après le raffinement 3D. Les reconstructions finales ont été affinées et filtrées localement par le post-traitement Relion (flux de travail de la reconstruction 3D, Fig. 2a supplémentaire). La résolution de la carte a été estimée au critère de 0,143 de la courbe FSC corrigée par randomisation de phase calculée entre deux demi-cartes raffinées indépendamment multipliées par un masque de solvant à bords doux. Les cartes ont été affichées à l'aide de UCSF ChimeraX27.

La reconstruction hélicoïdale a été réalisée avec RELION 3.1.213. La queue ϕKp24 connectée à une capside complète a été prélevée manuellement. Un total de 4707 segments sélectionnés manuellement ont été extraits avec une boîte de 450 pixels puis classés en 2D. La valeur de torsion initiale a été approximée à partir de la distance de croisement observée dans les micrographies brutes et les moyennes de classe 2D. La proportion la plus élevée de classes avec des limites claires a été utilisée comme modèle pour la sélection automatique finale. Les paramètres de sélection automatique hélicoïdale ont été optimisés sur un sous-ensemble de 741 micrographies. Après sélection automatique de l'ensemble des données, 114 132 particules ont été extraites et regroupées par 2. Plusieurs cycles de classification 2D ont été effectués pour éliminer les particules faussement positives et les caractéristiques contaminantes. Les particules restantes ont été soumises à plusieurs séries de classifications 3D en utilisant un cylindre sans particularité comme modèle 3D initial. Un raffinement tridimensionnel a été effectué, suivi d'une classification 3D où les particules ont été classées en quatre classes. Les particules de la classe avec le plus grand nombre ont été sélectionnées, ré-extraites à l'aide de données non regroupées et raffinées en 3D avec la symétrie C6. Les paramètres de montée et de torsion hélicoïdales pour le raffinement 3D final ont été analysés à l'aide de HI3D25 du laboratoire Jiang (tableau supplémentaire. 1), la montée et la torsion hélicoïdales sont déterminées à 39, 03 Å et 20, 89 °, respectivement. Les reconstructions finales ont été affinées et filtrées localement à l'aide du post-traitement Relion (flux de travail de reconstruction hélicoïdale, Fig. 11 supplémentaire). La résolution locale a été générée dans ResMap65 (Fig. 12 supplémentaire).

Les structures 3D des protéines ϕKp24 ont été déduites à l'aide d'Alphafold v2.0 via le bloc-notes ColabFold66 à : https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb. Les modèles initiaux des assemblages d'hexamères et de pentamères de capside ont été construits en ancrant de manière rigide le modèle gp372 prédit par AlphaFold2 dans les régions correspondantes de la carte cryo-EM de capside à l'aide de ChimeraX. Les modèles assemblés ont ensuite été affinés séparément à l'aide du protocole MDFF en cascade67, qui effectue des simulations MDFF séquentielles sur une série de cartes lissées gaussiennes de résolution croissante, se terminant par la carte expérimentale. Un total de simulations MDFF de 5 × 1 ns ont été réalisées pour chaque assemblage avec des contraintes de symétrie appliquées aux atomes du squelette de chaque monomère. Le modèle d'hexamère résultant a ensuite été ancré dans les densités entourant les assemblages d'hexamère et de pentamère pour produire des modèles de capside étendus, qui ont chacun ensuite été soumis à une simulation MDFF supplémentaire de 5 ns. Toutes les simulations ont été réalisées à l'aide de NAMD v2.1468 et du champ de force CHARMM3669. Des simulations MDFF ont été réalisées dans l'ensemble NVT à 300 K et en utilisant un solvant implicite de Born généralisé. Tous les atomes du squelette ont été ajustés à la carte de densité en utilisant une constante de couplage de 0,3 avec des contraintes harmoniques supplémentaires appliquées pour éviter la perte de structure secondaire, les erreurs de chiralité et la formation de liaisons cis-peptide. Des paramètres supplémentaires ont été pris comme valeurs par défaut fournies par le plugin MDFF dans VMD70.

La structure gp118 prédite par AlphaFold2 a été ajustée de manière rigide dans la carte de densité de queue à l'aide de ChimeraX, et la région de la gaine a ensuite été ajustée de manière flexible par simulation de dynamique moléculaire interactive dans ISOLDE26. Le progiciel PHENIX71 a été utilisé pour le raffinement en espace réel. La validation, y compris CC, RMSD à partir de longueurs et d'angles de liaison idéaux, a également été analysée à l'aide de PHENIX (Fig. 14 supplémentaire et Tableau supplémentaire. 2). Pour construire le modèle de la chambre à air, nous avons d'abord analysé toutes les protéines de ϕKp24 à l'aide de HMMER72 pour identifier la protéine du tube de queue par recherche d'homologie, car celle-ci n'était pas annotée dans le fichier Genbank. Ensuite, nous avons prédit la structure de la protéine gp119 du tube de queue à l'aide d'Alphafold2 et l'avons utilisé comme modèle pour construire le modèle de tube interne. Le modèle a été ajusté de manière rigide dans les régions correspondantes de la carte de densité de queue dans ChimeraX, optimisé dans ISOLDE et affiné dans l'application PHENIX en utilisant le corps rigide et l'espace réel. Les statistiques de CC et de raffinement, y compris la RMSD à partir des longueurs et des angles de liaison idéaux, ont été analysées par PHENIX (Fig. 20 supplémentaire et Tableau supplémentaire. 2).

Un réseau neuronal dense à échelle mixte de 100 couches39 a été formé pour détecter les fibres de queue du phage ϕKp24 dans les tomographies reconstruites. Ici, nous avons utilisé une configuration de formation similaire à celle utilisée dans d'autres études utilisant des réseaux denses à échelle mixte56,73,74. Pour plus d'informations sur cette configuration de formation, nous nous référons à ces études antérieures. Pour la formation, des segmentations manuelles des fibres de la queue de sept phages ont été utilisées, en plus de cinq régions sélectionnées manuellement sans aucune fibre présente. L'algorithme ADAM75 a été utilisé pour minimiser la perte d'entropie croisée, en utilisant des rotations et des retournements aléatoires pour l'augmentation des données. L'entraînement a été arrêté après qu'aucune amélioration significative de la perte n'ait été observée, ce qui a entraîné un temps d'entraînement de quelques heures. Par la suite, le réseau formé a été appliqué à tous les tomogrammes, ce qui a permis d'obtenir des cartes 3D des structures de fibres de queue. Pour analyser plus en détail ces cartes, une annotation manuelle supplémentaire a été effectuée sur les tomogrammes, indiquant pour chaque phage : (1) le centre de la structure fibreuse, (2) la position de la tête et (3) si la tête était pleine, vide , ou manquant. À l'aide de ces informations, une carte 3D de la structure des fibres de chaque phage a été extraite des cartes de fibres 3D, ce qui a donné des cartes individuelles pour 89 phages avec des têtes pleines, 338 phages avec des têtes vides et 181 phages avec des têtes manquantes. Les cartes de chaque groupe ont été alignées les unes sur les autres en utilisant à la fois les informations de position annotées manuellement et l'alignement automatique ultérieur en maximisant la corrélation croisée. Les cartes alignées ont ensuite été moyennées pour produire des formes de fibres «canoniques» pour chaque groupe. Les structures extraites et les structures moyennes ont été affichées à l'aide de Paraview76.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les cartes cryo-EM 3D générées dans cette étude ont été déposées à EMDB (Electron Microscopy Data Bank, https://www.ebi.ac.uk/emdb/) avec le code d'accession EMD-13862 pour la capside vide du phage jumbo de Klebsiella ϕKp24, code EMD-14356 pour la capside complète du phage jumbo de Klebsiella ϕKp24, et code EMD-14357 pour une longueur de la queue étendue. Les données de prédiction des protéines rapportées dans cet article seront partagées par le contact principal sur demande. Les coordonnées atomiques générées dans cette étude ont été déposées à wwPDB (Worldwide Protein Data Bank, http://www.wwpdb.org/) avec l'accession PDB ID : 8BFL pour les hexamères de la capside vide du phage jumbo de Klebsiella ϕKp24, PDB ID : 8BFP pour les pentamères-hexamères de la capside vide Klebsiella jumbo phage ϕKp24, PDB ID : 8AU1 pour une longueur de gaine externe de la queue étendue, et PDB ID : 8BFK pour une longueur de tube interne de la queue étendue.

Tout le code original a été déposé sur GitHub et est accessible au public https://github.com/dmpelt/jumbo-bacteriophage, https://doi.org/10.5281/zenodo.7277351. Toute information supplémentaire requise pour réanalyser les données rapportées dans ce document est disponible auprès du contact principal sur demande.

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Ce travail fait partie du programme de recherche Feuille de route nationale pour les infrastructures de recherche à grande échelle 2017-2018 avec le numéro de projet 184.034.014, qui est financé en partie par le Conseil néerlandais de la recherche (NWO). CKC et PJS sont financés par BBSRC, MRC et Wellcome. Les expériences et analyses de dépolymérase ont été soutenues par le National Science Centre, Pologne, avec les numéros de subvention UMO-2017/26/M/NZ1/00233 à ZD-K., AL et UMO-2020/38/E/NZ8/00432 à AOAL est titulaire d'une bourse postdoctorale junior de la Research Foundation—Flanders (FWO) avec le numéro de subvention 1240021 NDMP est soutenu par NWO avec le numéro de subvention 016.Veni.192.235. SJJB est soutenu par le NWO avec la subvention VICI VI.C.182.027 et le CoG du Conseil européen de la recherche (ERC) avec la subvention no. 101003229. RO a été soutenu par le China Scholarship Council (CSC) avec le numéro de projet 201906280465. Nous remercions Jamie Depelteau et Adam Sidi Mabrouk pour l'aide à la préparation des échantillons cryo-EM ; Wen Yang et Willem Noteborn pour la collecte de données cryo-EM ; Ludovic Renault et Frédéric Bonnet pour l'aide au traitement des données cryo-EM ; Boris Estrada-Bonilla pour le support technique ; Xiao Zhang pour son aide dans l'extraction des résultats du réseau et Lei Zhang pour ses commentaires critiques sur le manuscrit. Les souches de référence de K. pneumoniae utilisées dans cette étude (souches marquées CIP) ont été obtenues auprès de la Collection de l'Institut Pasteur (CIP, Paris, France).

Laboratoire clé du MOE pour la synthèse hors équilibre et la modulation de la matière condensée, École de physique, Université Xi'an Jiaotong, Xianning West Road 28, Xi'an, 710049, Chine

Ruochen Ouyang

Département des sciences microbiennes, Institut de biologie, Université de Leiden, Sylviusweg 72, 2333 BE, Leiden, Pays-Bas

Ruochen Ouyang, Vera CJ Williams et Ariane Briegel

Département de Bionanoscience, Université de technologie de Delft, Van der Maasweg 9, 2629 HZ, Delft, Pays-Bas

Ana Rita Costa et Stan JJ Brouns

Kavli Institute of Nanoscience, Delft, Pays-Bas

Ana Rita Costa et Stan JJ Brouns

Département de biochimie, Université d'Oxford, Oxford, Royaume-Uni

C.Keith Cassidy

Département de biologie des pathogènes et d'immunologie, Université de Wroclaw, Przybyszewskiego 63-77, 51-148, Wroclaw, Pologne

Aleksandra Otwinowska, Agnieszka Latka & Zuzanna Drulis-Kawa

Département de biotechnologie, Université de Gand, Valentin Vaerwyckweg 1, 9000, Gand, Belgique

Agnieszka Latka & Yves Briers

École des sciences de la vie et département de chimie, Université de Warwick, Coventry, CV4 7AL, Royaume-Uni

Phil J. Stansfeld

Leiden Institute of Advanced Computer Science, Université de Leiden, Niels Bohrweg 1, 2333CA, Leiden, Pays-Bas

Daniel M. Pelt

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Conceptualisation : AB, SJJB, YB, ZDK ; méthodologie : AB, RO, YB, ZDK, CKC ; logiciels : RO, CKC ; analyse formelle : RO, CKC, DMP, AL, AO, VW ; enquête : RO, ARC, CKC, AO ; ressources : AB, SJJB, DMP, YB, ZDK ; conservation des données : RO, AB, YB, ZDK ; rédaction du projet original : RO, AB, YB, DMP, ZDK ; rédaction—révision et édition RO, ARC, CKC, VW, PJS, DMP, SJJ, YB, AL, ZDK, AO ; visualisation : RO, VW, YB ; encadrement : AB, SJJB, YB, ZDK ; administration du projet : AB ; acquisition de financement : AB, SJJB, CKC, PJS, ZDK, AL, DMP, OR

Correspondance à Ariane Briegel.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Guy Schoehn et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Ouyang, R., Costa, AR, Cassidy, CK et al. Reconstruction haute résolution d'un bactériophage Jumbo infectant des bactéries encapsulées à l'aide de fibres de queue hyperramifiées. Nat Commun 13, 7241 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34972-5

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Reçu : 13 avril 2022

Accepté : 14 novembre 2022

Publié: 24 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-34972-5

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