Incorporation d'un GPI

May 18, 2023

Rapports scientifiques volume 5, Numéro d'article : 11856 (2015) Citer cet article

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Les vaccins anti-VIH devraient susciter des réponses immunitaires à la fois au niveau des portes d'entrée muqueuses pour bloquer la transmission et des compartiments systémiques pour éliminer les virus disséminés. La co-administration d'adjuvants muqueux s'est avérée essentielle pour induire une immunité muqueuse efficace par des vaccins non réplicatifs. Une nouvelle cytokine, GIFT4, conçue en fusionnant le GM-CSF et l'interleukine-4, a déjà été trouvée pour simuler la prolifération des cellules B et la fonction effectrice. Ici, une forme ancrée à la membrane de GIFT4 a été construite en fusionnant une séquence d'ancrage glycolipidique (GPI) et incorporée dans des particules de type virus VIH (VLP) enrichies en Env en tant qu'adjuvant moléculaire. Des cobayes ont été immunisés avec les VLP du VIH résultants par une voie d'immunisation de rappel intramusculaire-intranasale. Les VLP contenant GIFT4 ont induit des niveaux plus élevés de réponses d'anticorps systémiques avec une avidité de liaison significativement accrue et une ampleur et une puissance de neutralisation améliorées pour un panel de souches sélectionnées, ainsi que des niveaux plus élevés d'IgG et d'IgA sur plusieurs sites muqueux. Ainsi, les nouvelles VLP contenant GPI-GIFT4 ont le potentiel d'être développées en un vaccin prophylactique contre le VIH. L'incorporation de GIFT4 ancré au GPI dans les VLP en tant qu'adjuvant moléculaire représente une nouvelle approche pour augmenter leur immunogénicité.

Après trois décennies d'efforts pour comprendre la pathogenèse et les résultats de l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), nous sommes toujours confrontés au fait décourageant que 34 millions de personnes vivent avec le VIH-1, avec environ 2 millions de nouvelles infections et 1,6 million de décès chaque année1. ,2,3. La thérapie antirétrovirale combinée (ART) a montré un succès extraordinaire dans la réduction de la transmission du VIH et la prolongation de la vie. Cependant, le traitement ART ne restaure pas complètement la santé immunitaire et un certain nombre de complications liées à l'inflammation et/ou à l'immunodéficience peuvent persister tout au long de la vie4. La grande majorité des personnes infectées dans les pays en développement n'ont pas accès aux médicaments antiviraux. Un vaccin prophylactique reste la priorité absolue pour résoudre les défis et problèmes liés au VIH.

Les efforts les plus récents pour le développement d'un vaccin contre le VIH se sont concentrés sur l'obtention de réponses d'anticorps et de lymphocytes T largement neutralisants. Cependant, les progrès des études sur la pathogenèse du VIH et du VIS ont démontré que le stade précoce de l'infection au niveau de la porte d'entrée muqueuse est un goulot d'étranglement pour l'infection virale et des vulnérabilités virales potentielles ont été identifiées à ce stade5,6. Si les populations fondatrices de cellules infectées ne se développent pas suffisamment pour établir une infection auto-propagée, le virus risque d'être éliminé7. Compte tenu des petites populations fondatrices révélées dans les études de transmission muqueuse du VIS et déduites dans la transmission du VIH, cette étape offre l'opportunité maximale de prévention de la maladie à médiation vaccinale. La plupart des infections à VIH sont contractées par voie sexuelle8. Étant donné que le VIH utilise directement les cellules immunitaires comme hôtes et intègre l'ADN proviral dans les génomes des cellules cibles, les vaccins muqueux, plutôt que les vaccins conçus pour limiter la charge virale, sont plus susceptibles d'empêcher complètement l'infection disséminée8.

Un certain nombre d'études ont suggéré un rôle prometteur des cytokines en tant qu'adjuvants efficaces pour améliorer les réponses immunitaires9,10,11,12. Chez les macaques rhésus, un schéma vaccinal de rappel hétérologue avec co-expression du GM-CSF et des antigènes vaccinaux a conféré une meilleure protection contre l'infection par le SIV par rapport à un groupe sans adjuvant. Ceci était bien corrélé avec l'avidité élevée des anticorps IgG spécifiques d'Env induits dans le groupe traité avec l'adjuvant13,14. Il a été suggéré que le GM-CSF pourrait améliorer l'avidité des anticorps en recrutant et en stimulant la maturation des cellules présentatrices d'antigènes, en particulier les cellules dendritiques de la lignée myéloïde13,14. Il a été démontré que le GM-CSF et l'IL-4 induisent ensemble la différenciation des monocytes en cellules dendritiques15,16,17. Il a été démontré que l'IL-4 joue un rôle central dans la régulation de la différenciation des cellules T auxiliaires précurseurs dans la lignée Th2 et facilite donc les réponses immunitaires humorales18.

Nos études précédentes ont démontré que les protéines Env génétiquement modifiées peuvent être incorporées dans des particules pseudo-virales (VLP) avec une efficacité considérablement améliorée19. La protéine Env incorporée conserve ses épitopes conservés et probablement la conformation native lorsqu'elle est incorporée dans les VLP19. Sur la base de ces découvertes, la flagelline ancrée à la membrane a été construite et co-incorporée dans les VLP en tant qu'adjuvant. Les VLP chimériques du VIH (cVLP) résultantes ont provoqué des réponses immunitaires et muqueuses neutralisantes augmentées, ce qui indique en outre l'importance d'un adjuvant co-incorporé dans les VLP enrichies en Env pour déclencher des réponses immunitaires systémiques et muqueuses3. Dans une étude récente, nous avons découvert qu'une fusokine (protéine de fusion de deux cytokines) issue du GM-CSF et de l'IL4 (appelée GIFT4) conduit à une nouvelle fonction effectrice des lymphocytes B qui se manifeste par un profil de sécrétion de cytokine pro-immune altéré et un B robuste -réponse mitogène cellulaire20. Dans la présente étude, nous avons généré une forme liée à la membrane de GIFT4 en fusionnant la séquence signal du glycolipide CD59 (glycosylphosphatidyl-inositol, GPI) à la séquence C-terminale de GIFT4 dans le cadre et en incorporant le GIFT4 ancré à la membrane dans des VLP enrichis en Env. Nous avons constaté que ces cVLP hébergeant à la fois une densité élevée d'Env et de GIFT4 ancré à la membrane ont suscité des réponses d'anticorps spécifiques à Env hautement augmentées avec une qualité améliorée, comme en témoignent une avidité et une activité de neutralisation accrues. Ces données démontrent que les cVLP ont le potentiel d'être développés davantage en un vaccin muqueux contre le VIH.

Un diagramme de la forme liée à la membrane du gène GIFT4 est présenté sur la figure 1a. Le peptide signal de la mélittine (SP) et les séquences codant pour le signal d'ancrage CD59 GPI ont été fusionnés aux extrémités 5 'et 3' de la séquence codant GIFT4 dans le cadre pour faciliter l'insertion membranaire de GPI-GIFT421. Western blot (Fig. 1b) utilisant un anticorps anti-GM-CSF a détecté une bande migrant à 37 kDa dans le lysat de cellules sf9 infectées par des baculovirus recombinants (rBV) exprimant le gène GPI-GIFT4 (piste 1 sur Fig. 1b), correspondant à la taille attendue de GIFT4 ancré GPI. L'ancrage membranaire du GPI-GIFT4 exprimé a en outre été démontré par l'intensité de fluorescence accrue mesurée par analyse FACS des cellules infectées par le rBV après coloration de la surface cellulaire avec des anticorps anti-GM-CSF, suivie d'anticorps secondaires conjugués à la PE (Fig.1c ).

Diagramme de la forme ancrée au GPI de GIFT4 et de l'expression des cellules d'insectes.

a, une présentation schématique du gène codant pour GPI-GIFT4. Les séquences codantes pour la mélittine SP et l'ancre CD59-GPI murine ont été fusionnées aux extrémités 5 'et 3' de l'ADN codant pour GIFT4, respectivement, pour former le gène de pleine longueur. b, expression cellulaire de GPI-GIFT4. Des Western blots ont été développés avec un anticorps anti-GM-CSF. Piste 1, lysat de cellules entières d'un échantillon de cellules d'insectes infectées par le rBV exprimant GPI-GIFT4 ; Piste 2, protéine GM-CSF purifiée; Piste 3, lysat de cellules entières de cellules infectées par le rBV exprimant l'Env du VIH comme témoin. c, analyse FACS de l'expression de surface cellulaire GPI-GIFT4 dans des échantillons de cellules d'insectes infectés par le rBV. Rouge, contrôle d'anticorps d'isotype ; Bleu, Cellules témoins + anticorps anti-GMCSF ; Vert, cellules exprimant GPI-GIFT4 + anticorps anti-GMCSF.

Les VLP ont été produites en utilisant le système d'expression rBV dans des cellules d'insectes. La composition protéique des VLP résultantes a été caractérisée par western blot en utilisant des anticorps spécifiques de Gag, Env ou GM-CSF. Comme le montre la figure 2a (a.2), il a été observé que l'Env incorporée dans les VLP Env / Gag standard (sVLP, voie 2) ou cVLP (voie 4) avait une masse moléculaire d'environ 120 kDa19. Une bande migrant à la taille attendue de GPI-GIFT4 a été observée dans les VLP cVLP et GIFT4/Gag (pistes 3 et 4 dans a.3), démontrant l'incorporation de GPI-GIFT4 dans ces VLP. Les résultats présentés dans la voie 4 de a.2 et a.3 sur la figure 2a indiquent en outre que GIFT4 et Env ancrés à la membrane peuvent être co-incorporés dans les cVLP du VIH. Pour vérifier que l'intégration de GIFT4 dans les VLP se fait par l'ancrage GPI sur la surface de la membrane, un test FACS a été effectué. GIFT4 a été détecté par l'intensité de fluorescence accrue dans les cVLP (courbe verte sur la figure 2b) mais pas dans les sVLP (courbe bleue sur la figure 2b) après la coloration des anticorps anti-GM-CSF. De plus, le signal GIFT4 des cVLP a été complètement éliminé par traitement avec PIPLC, une phospholipase spécifique du phosphatidylinositol qui libère des molécules ancrées au GPI des membranes22, comme le montre la figure 2b (courbe rouge). Ensemble, ces données ont démontré que GIFT4 peut être incorporé dans les VLP, ou co-incorporé dans les cVLP, grâce à l'ancrage GPI.

Caractérisation des VLP.

a, analyse Western blot des composants protéiques des VLP. Des échantillons de VLP contenant 1 μg de protéines totales ont été chargés pour SDS-PAGE suivi d'un transfert Western. Les bandes protéiques ont été sondées avec : a.1, anticorps anti-HIV Gag ; a.2, anticorps polyclonaux anti-gp120 ; a.3, anticorps anti-GM-CSF. Piste 1, Gag uniquement VLP ; Piste 2, sVLP; Voie 3, VLP GIFT4/Gag ; piste 4, cVLP; M, poids moléculaire (kDs). b, analyse FACS de l'ancrage de GIFT4 GPI dans les VLP à l'aide d'un anticorps anti-GM-CSF. Des échantillons de VLP (1 ml à 1 mg/ml) ont été utilisés pour la coloration des anticorps comme décrit pour la coloration de la surface cellulaire sur la figure 1. Bleu, sVLP ; Vert, cVLP ; Rouge, cVLP post-traitement PIPLC. c, prolifération de splénocytes de cobaye in vitro stimulée par les VLP ou GIFT4. Des cellules spléniques isolées de cobaye ont été cultivées in vitro pendant 2 jours en présence de 1 μg/ml de différentes VLP du VIH ou du GIFT4 soluble (50 ng/ml) et photographiées au microscope EVOS. C.1 à c.5, cellules traitées avec du PBS, du GIFT4 soluble, des sVLP, des GIFT4/Gag VLP ou des cVLP, respectivement. Barre d'échelle, 1000 μm.

Pour déterminer si GPI-GIFT4 incorporé dans les VLP conservait encore une activité fonctionnelle, nous avons testé la puissance des cVLP à induire la prolifération des lymphocytes de la rate de cobaye in vitro. Comme le montre la figure 2c, après une culture de 2 jours en présence de 1 μg/ml de cVLP ou de GIFT4/Gag VLP, un nombre significativement plus élevé de cellules spléniques a proliféré en colonies avec des colonies de plus grande taille (c.4 et c.5) par rapport au contrôle (c.1) ou aux sVLP (c.3)., La prolifération a également été observée dans les cellules traitées par sVLP (c.3), bien qu'à un niveau inférieur par rapport à celui du GIFT4 contenant des VLP (c .4 et c.5 sur la Fig. 2c), démontrant que les VLP elles-mêmes sont également des stimulateurs lymphocytaires. Ces résultats indiquent que le GPI-GIFT4 incorporé dans les VLP conserve l'activité biologique du GIFT4 soluble dans la stimulation de la prolifération lymphocytaire20.

Pour déterminer si GIFT4 incorporé dans les VLP du VIH améliore les réponses des anticorps contre l'immunogène Env, des groupes de cobayes ont été immunisés avec un amorçage intramusculaire (im) suivi de deux rappels intranasaux (in) avec des sVLP, des cVLP, des GIFT4/Gag VLP ou Gag uniquement VLP , respectivement. Les niveaux d'IgG sériques immunitaires spécifiques à HIV Env à 2 semaines après chaque immunisation ont été évalués par ELISA. Les résultats présentés sur la figure 3a (présentés sous forme de titres de point final) démontrent que les cVLP ont induit des réponses d'anticorps sériques avec des titres plus élevés que ceux observés avec les sVLP (P <0, 05). Après trois immunisations (saignement 3 à la semaine 10, Fig. 3a), les cobayes immunisés avec les cVLP présentaient des taux d'IgG 5 fois plus élevés que ceux induits par les sVLP (moyenne de 24 600 contre 4 666, P < 0,01). Ces résultats ont indiqué que la co-incorporation du GIFT4 ancré à la membrane dans les VLP est très efficace pour améliorer les réponses immunitaires anti-Env. Bien que les cVLP aient induit des réponses IgG élevées, l'IgA spécifique de Env dans les sérums immuns n'a pas été détectée.

Titres sériques IgG et sous-type IgG.

Les cobayes ont été immunisés avec des VLP Gag uniquement, des VLP GIFT4/Gag, des sVLP ou des cVLP dans la voie d'amorçage-deux dans la voie de rappel aux semaines 0, 4, 8, respectivement, et les sérums immuns ont été collectés 2 semaines après chaque immunisation à la semaine 2 , 6, 10, respectivement. a, titres de point final d'IgG sériques ; b, titres IgG1 des sérums immuns du saignement 3 (semaine 10) ; c, titres de point final d'IgG2 des sérums immuns du saignement 3. Les dosages ont été effectués comme décrit dans Matériels et méthodes. Les résultats sont exprimés en moyennes ± écarts-types. Le test t de Student a été utilisé pour l'analyse statistique. L'analyse a été effectuée en utilisant GraphPad Prism version 5.00 pour Windows (San Diego, Californie). Les valeurs de P inférieures à 0,05 (P < 0,05) ont été considérées comme statistiquement significatives. *P < 0,05 ; **P < 0,01.

Nous avons évalué les profils des sous-classes d'IgG sériques dans les sérums du saignement 3 et observé que les sVLP et les cVLP induisaient à la fois des réponses immunitaires IgG1 et IgG2. Le rapport IgG2/IgG1 pour le groupe sVLP est d'environ 9 et d'environ 7 pour le groupe cVLP (Fig. 3b et c). Sur la base de ces données, nous avons conclu que l'IgG2 domine les réponses IgG aux VLP du VIH. Comparé à IgG1 et G2, G3 est beaucoup plus faible bien que IgG3 n'ait pas été mesuré dans cette étude en raison de l'absence d'anticorps anti-IgG3 commerciaux. Contrairement aux sous-types d'IgG humains, notamment G1, G2, G3 et G4, les cobayes n'ont pas de sous-type IgG4. Bien que les cVLP aient induit des titres d'IgG plus élevés que les sVLP, leurs réponses en anticorps montrent des profils de sous-types d'IgG similaires.

La séquence de GIFT4 utilisée provient de souris20. Ainsi nous avons voulu savoir si des réponses anticorps spécifiques de GIFT4 étaient induites chez le cobaye et si ces anticorps diminuent la fonction adjuvante de GIFT4 lors des immunisations ultérieures. Cependant, nous n'avons pas observé d'anticorps spécifiques à GIFT4 dans les sérums immuns (données non présentées).

Il est bien établi que l'immunité muqueuse est essentielle pour contrôler une primo-infection par le VIH-1. Dans la présente étude, nous avons utilisé un régime d'immunisation qui contenait une injection complétée par deux injections de rappel, qui devait provoquer des réponses immunitaires muqueuses améliorées. Pour déterminer si les cVLP induisent des réponses immunitaires muqueuses améliorées par ce schéma d'immunisation, nous avons évalué les niveaux sécrétoires d'IgA et d'IgG spécifiques d'Env dans la salive et les lavages vaginaux après trois immunisations. Comme le montrent les figures 4a, b, les titres d'IgG et d'IgA spécifiques à Env dans les échantillons de salive se sont avérés beaucoup plus élevés dans le groupe cVLP que dans le groupe sVLP. Remarquablement, à la semaine 10, les cobayes immunisés par cVLP ont également montré des niveaux d'IgG environ 5 fois plus élevés (Fig. 4c) et des niveaux d'IgA 6 fois plus élevés (Fig. 4d) dans les lavages vaginaux que ceux induits chez les cobayes immunisés par sVLP, démontrant que le GIFT4 est un adjuvant efficace pour déclencher des réponses immunitaires muqueuses.

Titres d'anticorps muqueux au point final.

Des échantillons de muqueuse ont été prélevés à la semaine 12, 4 semaines après la dernière immunisation de rappel. Les titres de point final IgG et IgA spécifiques à Env ont été détectés par ELISA comme décrit dans Matériels et méthodes. a, IgG salivaire ; b, IgA salivaire ; c, IgG vaginale ; d, IgA vaginale. Les données ont été représentées sous forme de moyennes ± écarts-types. *P < 0,05 ; **P < 0,01.

L'avidité des anticorps pour l'antigène du VIH est faible au stade précoce de l'infection et augmente à mesure que l'infection progresse tandis que l'anticorps mûrit23. Les anticorps neutralisants avec une avidité accrue évoluent au cours de la maturation. Une augmentation significative de l'avidité a été rapportée après une exposition répétée à l'antigène24. Plusieurs études récentes ont également montré des corrélations entre l'avidité des anticorps non neutralisants et l'efficacité protectrice du VIH25,26,27. Par conséquent, l'analyse de l'avidité des anticorps est un moyen efficace d'évaluer la qualité des anticorps pour fournir une protection. Pour déterminer si les cVLP induisent des réponses anticorps à Env avec une avidité accrue, six virus pseudotypés Env des clades B et C ont été comparés. Parce que Env est inséré dans l'enveloppe pseudovirale, comme c'est le cas dans les virions, Env dans les pseudovirus et les virions est fonctionnellement équivalent, se liant aux cellules cibles et médiant la fusion de la membrane virale-cellule hôte. Des tests de neutralisation à base de virus pseudotypés ont été largement utilisés pour évaluer la capacité d'un anticorps à bloquer l'infection par le VIH. Ainsi, l'avidité des anticorps vis-à-vis du pseudovirus Env devrait refléter la liaison des anticorps aux particules de VIH. Les résultats présentés sur la figure 5 ont démontré que les anticorps sériques dans le groupe cVLP présentaient une avidité significativement accrue par rapport aux sérums du groupe immunisé par sVLP. Comme le montre la figure 5, les cVLP ont suscité des anticorps avec une avidité accrue avec des IA d'environ 40 pour la liaison à 4 des 6 souches du clade B (figure 5a) ainsi qu'à 4 des 6 virus du clade C (figure 5b), par rapport à sVLP avec des IA ne dépassant pas 20 (P < 0,05). Des niveaux intermédiaires d'amélioration de l'avidité ont été trouvés pour la souche 6535.3 dans le clade B et ZM214M.PL15 dans le clade C et aucun changement n'a été observé avec AC10.0.29 dans le clade B ou ZM109F.PB4 (clade C) (P > 0,05). Fait intéressant, bien que les cVLP aient suscité une avidité accrue pour les sVLP comme observé ci-dessus, l'avidité pour les Env parmi ces souches n'était pas significativement différente. En raison des niveaux d'anticorps beaucoup plus faibles dans les échantillons de muqueuses, l'avidité des IgG et des IgA dans les échantillons de muqueuses n'était pas détectable, comme c'est le cas pour les IgA sériques.

Avidité des IgG sériques immunitaires vis-à-vis de pseudovirus sélectionnés.

Des dosages d'avidité ont été effectués avec des sérums immuns du saignement 3 (à la semaine 10) de cobayes immunisés avec les sVLP et les cVLP. a, indices d'avidité des IgG sériques immunitaires contre les pseudovirus du clade B ; b, indices d'avidité des IgG sériques immunitaires contre les pseudovirus du clade C. Les données sont exprimées en moyennes ± écarts-types. *P < 0,05.

Les anticorps neutralisants peuvent bloquer directement l'infection virale en se liant étroitement à l'Env fonctionnel, en assurant l'inhibition de l'entrée, l'agrégation virale, l'inactivation dépendante du complément ou en déclenchant une cytotoxicité à médiation cellulaire/inhibition virale dépendante des anticorps (ADCC/ADCVI)28,29,30 et sont donc des cibles idéales pour être induites par un vaccin. Nos résultats démontrent que les cVLP du VIH contenant GIFT4 à ancrage GPI induisaient des titres d'IgG plus élevés que les sVLP. Nous avons en outre étudié la réactivité de neutralisation de ces anticorps à l'aide d'un panel de pseudovirus Env des clade B et C du VIH, le même panel de virus que celui utilisé pour comparer l'avidité de liaison des anticorps à la Fig. 5. Comme le montre la Fig. 6a, la réactivité de neutralisation du sérum a suscité par le groupe cVLP contre PVO.4, un virus de niveau 3 qui montre une forte résistance à la neutralisation31 et RHPA4259.7 (niveau 2) ont été améliorés (environ 30 à 40 % des virus ont été neutralisés à moins de 20, P < 0,05) par rapport au groupe sVLP. Sur les 6 virus de clade C testés, les sérums immuns du groupe cVLP ont présenté une neutralisation accrue contre Du156.12 (niveau 2), ZM214M.PL15 (niveau 2) et ZM109F.PB4 (intermédiaire) par rapport au groupe sVLP (P < 0,05) (Fig. 6b). Les groupes VLP et sVLP contenant GIFT4 ont montré des titres de neutralisation similaires à ceux des autres virus (P > 0,05). Ces résultats indiquent en outre un effet adjuvant du GIFT4 ancré à la membrane dans les cVLP pour induire des réponses d'anticorps avec une ampleur et une puissance de neutralisation améliorées.

Activité neutralisante.

Des sérums immuns de la saignée 3 provenant de sVLP et d'animaux immunisés contre cVLP ont été testés pour l'activité neutralisante. Le facteur de dilution final des sérums immuns était de 40 fois. a, neutralisation contre les pseudovirus du clade B. b, neutralisation contre les pseudovirus du clade C. Les données ont été exprimées sous forme de moyennes ± écarts-types. *P < 0,05.

Un objectif majeur des vaccins contre le VIH est de provoquer des réponses immunitaires au niveau de la surface muqueuse pour bloquer la transmission, ainsi que dans les compartiments systémiques pour éliminer les virus disséminés. Les vaccins administrés par voie systémique ne parviennent généralement pas à stimuler de fortes réponses immunitaires muqueuses. Dans la présente étude, nous avons développé des cVLP avec une co-incorporation efficace de HIV Env avec une nouvelle fusokine, GIFT4, en tant que facteur de co-stimulation, dans les mêmes particules. Les cVLP résultants ont été évalués pour leur capacité à susciter des réponses d'anticorps améliorées dans les compartiments systémiques ainsi que les surfaces muqueuses. Cette étude intègre plusieurs approches pour améliorer les réponses immunitaires au VIH. Celles-ci incluent : 1) l'incorporation améliorée d'Env dans les VLP pour augmenter la densité des immunogènes ; 2) construction et co-incorporation d'une forme liée à la membrane de GIFT4 dans des cVLP pour améliorer encore l'immunogénicité en stimulant la prolifération et l'activation des lymphocytes B ; 3) emploi d'une voie systémique d'amorçage/stimulation muqueuse pour induire des réponses immunitaires systémiques ainsi que muqueuses. Sur la base des résultats actuels, cette stratégie vaccinale intégrée contre le VIH a le potentiel d'être développée davantage pour produire un vaccin prophylactique contre le VIH à l'avenir.

La plupart des vaccins actuels sont administrés par injection intramusculaire et induisent des réponses immunitaires systémiques. Cependant, l'immunité muqueuse est rarement induite par une immunisation systémique. Étant donné que la transmission muqueuse est la voie prédominante de l'infection par le VIH et représente jusqu'à 80 % de l'incidence du sida dans le monde32, l'immunité fonctionnant au niveau des portes d'entrée muqueuses est extrêmement importante pour prévenir l'infection primaire par le VIH-1. En raison de l'efficacité relativement faible de l'infection par le VIH sur les surfaces muqueuses, même une amélioration modeste des réponses immunitaires protectrices des muqueuses médiées par les anticorps pourrait avoir un effet significatif sur la réduction de l'incidence de la maladie7. Ainsi, un vaccin efficace contre le VIH peut devoir induire à la fois une immunité muqueuse pour réduire la fréquence de l'infection initiale et éventuellement bloquer la fuite du virus de la muqueuse génitale et intestinale vers les organes lymphoïdes systémiques et une immunité systémique, telle que des réponses d'anticorps largement neutralisantes, pour éliminer tout virus disséminé. Dans la présente étude, la voie d'immunisation de rappel intramusculaire amorcée par voie intranasale a été utilisée pour induire une amélioration de l'immunité à la fois au niveau des compartiments systémiques et des surfaces muqueuses.

Des études antérieures ont suggéré l'importance de la cavité nasale pour l'induction de réponses immunitaires muqueuses et systémiques en raison de la présence de centres germinatifs contenant B, T, du plasma et des cellules présentatrices d'antigènes (APC)33. Il est également bien établi que les tissus lymphoïdes stratégiquement positionnés au site d'entrée des voies respiratoires et digestives sont importants dans la captation des antigènes. Par deux injections de rappel avec les cVLP nouvellement construits, des niveaux très élevés d'IgG et d'IgA spécifiques de l'Env du VIH muqueux ont été induits par rapport aux sVLP administrés par la même voie. Les anticorps sécrétés dans la lumière sont connus pour fournir une barrière immunologique pour limiter la pénétration des antigènes dans les muqueuses et sont fortement associés à la protection contre l'infection par le VIH-134,35,36. Bien que des réponses IgA et IgG muqueuses robustes aient été observées chez les animaux immunisés avec des cVLP, les IgA sériques n'étaient pas détectables. Étant donné que l'IgG prédomine sur l'IgA dans les sérums immuns et peut concurrencer l'IgA en se liant au même épitope dans les antigènes de revêtement dans l'ELISA, une IgA indétectable peut indiquer que cet anticorps est absent ou à de faibles titres dans les sérums immuns. Dans une analyse récente des corrélats immunitaires dans l'essai RV144, les taux sériques d'IgA se sont avérés inversement corrélés à la protection contre le VIH37. De faibles niveaux d'IgA sériques dans les sérums immuns peuvent donc être une conséquence avantageuse de l'immunité induite par les VLP contenant GIFT4.

Une réponse anticorps idéale devrait inclure non seulement des titres élevés d'anticorps, mais également une avidité élevée des anticorps ainsi qu'une activité neutralisante24,25,26,27. Nous avons observé une avidité accrue des anticorps et une ampleur et une puissance neutralisantes dans le groupe immunisé par cVLP, ce qui appuie la conclusion selon laquelle l'effet adjuvant de GPI-GIFT4 permet au système immunitaire de traiter ou de présenter plus efficacement les épitopes des lymphocytes B résidant dans Env. Bien qu'une corrélation entre l'avidité des anticorps et la neutralisation n'ait pas été évidente, l'avidité accrue observée peut être due à des anticorps non neutralisants. D'autres études récentes ont également montré des corrélations entre l'avidité des anticorps non neutralisants et l'efficacité protectrice du VIH25,26,27. Les autres mécanismes différents peuvent également être impliqués dans la fonction antivirale de l'immunité, tels que l'ADCC et la réponse des cellules T au niveau des sites muqueux, y compris les tissus muqueux intestinaux et rectaux/vaginaux, pour empêcher l'entrée du virus, contenir la réplication du virus échappé et retarder la mise en place de une infection systémique38,39,40,41,42 . L'étude s'est concentrée principalement sur les réponses des anticorps (niveaux, avidité et puissance neutralisante) car l'activité de gain de fonction de GIFT4 s'est avérée faciliter les réponses des lymphocytes B20.

Le GM-CSF s'est avéré être un adjuvant efficace pour les vaccins contre le VIH dans un certain nombre d'études. Chez les macaques rhésus, des anticorps anti-Env avec une avidité améliorée ont été obtenus par co-délivrance d'ADN GM-CSF avec Gag, Pol et Env ADN suivi d'un rappel MVA13. Le groupe avec adjuvant a montré un meilleur contrôle de la provocation et de l'infection virale réémergente13. De plus, les APC sont importantes pour induire une réponse immunitaire robuste. Des études antérieures ont montré que le GM-CSF associé à l'IL-4 optimise la croissance des DC humaines in vitro17. Les deux cytokines sont connues pour favoriser la différenciation et la maturation des monocytes sanguins humains non en croissance ou des précurseurs proliférants dérivés de la moelle osseuse43. Les mécanismes sous-jacents aux réponses immunitaires améliorées observées dans les études susmentionnées ainsi que dans les études actuelles peuvent être étroitement liés au rôle du GM-CSF et de l'IL-4, ou à son gain de fonction de GIFT4, dans la promotion de la différenciation et de la maturation des monocytes. dans les cellules dendritiques (DC)16. Différent des cytokines simples ou de leur mélange, les fusokines modifiées peuvent générer de nouvelles fonctions en tant que stimulateurs des lymphocytes, comme démontré précédemment20,44,45. GIFT4 s'est avéré générer une activité de gain de fonction pour induire une prolifération robuste des cellules B et conduire à des réponses améliorées des cellules B20. En couplant davantage une ancre GPI pour permettre à GIFT4 d'être co-incorporé dans les VLP avec Env, le stimulateur d'antigène intégré dans les mêmes cVLP peut fournir des cellules immunitaires ciblées pour une meilleure présentation et prolifération de l'antigène. L'efficacité adjuvante améliorée par la co-incorporation d'un stimulateur immunitaire dans les VLP, par rapport au mélange avec les VLP, a également été démontrée précédemment46,47,48. La prolifération robuste des populations de cellules B amorcées par Env stimulées par GIFT4 peut être un facteur important pour les réponses anticorps améliorées chez les animaux immunisés par cVLP dans la présente étude. De plus, étant donné que GIFT4 est dérivé de cytokines (GM-CSF et IL-4), il est hautement sûr lorsqu'il est utilisé comme adjuvant moléculaire.

Dans cette étude, la grande valeur de GIFT4 ancré au GPI dans les VLP en tant que nouvel adjuvant est soutenue par des réponses d'anticorps systémiques et muqueuses améliorées avec une avidité accrue et une capacité de neutralisation élargie. Ces données démontrent le potentiel des VLP du VIH contenant GIFT4 pour le développement d'un vaccin efficace contre le VIH pour l'administration par la voie d'immunisation de rappel immédiate. L'incorporation du GIFT4 ancré à la membrane peut être une approche générale pour améliorer l'immunogénicité de divers vaccins VLP.

Cette étude a été réalisée dans le strict respect des recommandations du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health. Toutes les études sur les cobayes ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Emory (IACUC). L'IACUC a émis un numéro de protocole de 079-2008Y pour cette étude. Des cobayes femelles (âgées de 8 semaines) ont été achetées au Jackson Laboratory et hébergées dans l'animalerie de l'Université Emory. L'immunisation et les saignements ont été effectués sous anesthésie induite et maintenue avec du chlorhydrate de kétamine et de la xylazine et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance.

Pour générer un gène codant pour le GIFT4 ancré à la membrane, les séquences codantes du peptide signal de la mélittine d'abeille et de l'ancre GPI CD59 murine ont été fusionnées aux extrémités 5′ et 3′ du gène codant GIFT4 (dérivé de séquences de souris20) dans le cadre pour obtenir le gène codant de pleine longueur d'un GIFT4 ancré à GPI (GPI-GIFT4) en chevauchant PCR20,49,50,51. Le gène codant pour GPI-GIFT4 résultant a ensuite été cloné dans le plasmide vecteur de transfert pFastBac-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Un baculovirus recombinant (rBV) exprimant GPI-GIFT4 a été généré en utilisant le système d'expression de protéine de cellule d'insecte Bac-to-Bac (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Pour confirmer si GIFT4 ancré au GPI peut être transloqué vers la membrane et exprimé sur les surfaces cellulaires, des cellules sf9 ont été infectées avec des rBV exprimant GPI-GIFT4 à un MOI de 2. Deux jours plus tard, les cellules ont été récoltées et colorées avec du rat anti-souris GM -Anticorps CSF (BD Biosciences) suivis d'anticorps secondaires conjugués à la PE. Un anticorps anti-souris de rat non apparenté à GIFT4 a servi de contrôle d'anticorps. Les cellules Sf9 infectées par des rBV exprimant Env ont été colorées avec de l'anti-GM-CSF suivi d'anticorps secondaires conjugués à la PE comme autre contrôle. L'intensité de la fluorescence a été enregistrée et analysée par FACS avec un cytomètre en flux BD FACSCanto II.

Quatre VLP différentes (VLP Gag uniquement, VLP GIFT4/Gag, sVLP et cVLP) ont été produites à des fins de comparaison en utilisant un système d'expression de cellules d'insectes tel que décrit précédemment19. Pour la production de cVLP, des cellules sf9 ont été co-infectées avec trois rBV exprimant respectivement un consensus Env du VIH modifié (ConS) qui a montré un niveau élevé d'incorporation dans les VLP, GPI-GIFT4 et Gag, à des MOI de 6, 2 et 3, respectivement3,19. Des VLP standard et des VLP Gag uniquement ont été produits comme décrit19. Les VLP GIFT4/Gag ont été produites par co-infection de cellules sf9 avec des rBV exprimant GPI-GIFT4 et Gag à des MOI de 2 et 3, respectivement. Deux jours après l'infection, le surnageant de culture a été collecté et les VLP ont été concentrées par filtration sur fibre poreuse à l'aide du système de paillasse Quixstand (GE Healthcare, Uppsala, Suède) suivie d'une ultracentrifugation à gradient de densité de saccharose comme décrit précédemment50. Pour quantifier le rendement des VLP purifiées, la concentration en protéines de chaque échantillon a été estimée à l'aide du test de protéines Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA).

Pour déterminer si le GIFT4 ancré dans les cVLP conserve l'activité biologique du GIFT4 soluble, nous avons testé si les cVLP peuvent induire la prolifération des cellules spléniques de cobayes in vitro. Les cellules spléniques ont été cultivées dans du milieu RPMI complet en présence de 1 μg/ml de sVLP, de cVLP ou de GIFT4/Gag VLP, respectivement. GIFT4 soluble (50 ng/ml) a été utilisé comme témoin positif. Après incubation à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 2 jours, la prolifération des cellules a été observée et imagée sous un microscope EVOS (Life Technologies, Grand Island, NY).

Des cobayes femelles de souche Hartley ont été obtenus auprès du Charles River Laboratory (Wilmington, MA) et ont été séparés en quatre groupes (5 animaux par groupe). Les groupes ont été immunisés avec un régime d'immunisation comprenant un amorçage intramusculaire (im) suivi de deux rappels intranasaux (in) avec des vaccins VLP à des intervalles de 4 semaines. Pour chaque immunisation, les animaux des groupes Gag uniquement et GIFT4/Gag VLP ont été immunisés avec 100 μg de protéines totales, respectivement. Les standards et les cVLP ont été administrés en utilisant des doses contenant 10 μg d'Env, respectivement. En moyenne, une dose de VLP contenant GIFT4 (cVLP et GIFT4/Gag VLP) contenait environ 2 μg de GIFT4 calibré à l'aide de GIFT4 soluble. Deux semaines après chaque immunisation, des sérums immuns ont été prélevés par saignement de la veine cave de cobayes anesthésiés.

Des échantillons de muqueuse ont été prélevés à la semaine 12, 4 semaines après la dernière immunisation de rappel. Les lavages vaginaux ont été collectés en lavant 250 μl de PBS par voie intravaginale avec une aiguille d'alimentation orale (Braintree Scientific Inc., Braintree, MA)52. Pour collecter des échantillons de salive, des Q-tips en coton médical pré-pesés ont été insérés dans la bouche et laissés pendant 5 min, puis pesés et extraits avec du PBS plus 0,02% de Tween 20. Les échantillons ont été brièvement centrifugés et les surnageants ont été filtrés à travers un filtre de 0,22 μm et stocké à -80 ° C pour une analyse plus approfondie.

Pour déterminer les réponses des anticorps IgG, IgG1, IgG2 et IgA spécifiques de l'Env du VIH, des plaques ELISA (Nunc-Immuno Plate MaxiSorp™, Nunc Life Technologies, Bâle, Suisse) ont été recouvertes de ConS Env gp120 purifié à partir de cellules 293T infectées par un virus recombinant de la vaccine3, 19. Le facteur de dilution le plus élevé qui donne une DO 450 de deux fois celle de l'échantillon naïf à la dilution a été désigné comme titre d'anticorps au point final.

Chacun des six plasmides d'expression env d'un panel de référence standard du NIH pour les clades B et C, respectivement, a été sélectionné pour générer des virus pseudotypés Env pour des tests d'avidité de liaison et de neutralisation. Ces virus de niveau 2/3 comprenaient 6535.3, PVO.4, AC10.0.29, TRJO4551.58, RHPA4259.7 et CAAN5342.A2 dans le clade B et Du156.12, Du422.1, ZM214M.PL15, ZM249M.PL1, ZM109F. PB4 et CAP45.2.00.G3 dans le clade C53,54.

Des pseudovirus ont été préparés en transfectant des cellules 293T (6–8 × 106 cellules dans un milieu de croissance de 15 ml dans un flacon de culture cellulaire T-75) avec 10 μg d'un plasmide d'expression env spécifique et 10 μg du vecteur squelette du VIH-1 déficient env (pSG3△Env) en utilisant Lipofectamine 2000 (invitrogen). Les pseudovirus contenus dans les surnageants de culture ont été récoltés 2 jours après la transfection et filtrés à travers un filtre de 0,45 μm. La dose infectieuse de culture tissulaire à 50 % (TCID50) de chaque pseudovirus a été mesurée et les échantillons ont été stockés à -80 °C pour une analyse plus approfondie.

Des tests de neutralisation ont été effectués dans des cellules JC53-BL comme décrit précédemment avec une modification mineure3. En bref, les cellules JC53-BL ont été ensemencées à 25 000 cellules par puits dans une plaque à 96 puits 24 h avant l'infection. Des échantillons de sérum de cobaye ont été inactivés par la chaleur à 56 ° C pendant 30 min et dilués à 1:20 dans 10% FCS – DMEM jusqu'à un volume final de 25 μl et ajoutés à 25 μl de stock de pseudovirus dilué dans 10% FCS – DMEM contenant 50 particules infectieuses (dilution finale du sérum, 1:40). Les virus mélangés au milieu seulement ont été utilisés comme témoins. Les mélanges virus-sérum immun ont été incubés à 37 ° C pendant 1 h, puis ajoutés à des cellules JC-53 avec du DEAE-dextran à une concentration finale de 15 μl / ml. Après 2 h d'incubation, 200 µl supplémentaires de DMEM complet ont été ajoutés. Deux jours après l'infection, le milieu a été retiré et les cellules ont été fixées et colorées comme décrit par Chackerian et al55. L'activité de neutralisation des anticorps est présentée en pourcentage de neutralisation et calculée comme [(nombre moyen de foyers bleus dans les puits de contrôle - nombre moyen de foyers bleus dans les puits d'échantillons de mélange virus-sérum)/(nombre moyen de foyers bleus dans les puits de contrôle)] × 100 %.

Des plaques de microtitration à 96 puits ont été recouvertes de 100 μl de pseudovirions Env (4 μg / ml) dans un tampon de revêtement (carbonate de sodium 0, 1 M, pH 9, 5) à 4 ° C pendant la nuit, les échantillons de sérum dilués ont été ajoutés aux puits et incubés pendant 1, 5 heures à 37 °C. Le test a été effectué en utilisant des titrages parallèles de sérums immuns avec ou sans traitement avec du thiocyanate de sodium 1,5 M (NaSCN) pendant 15 min pour distinguer la liaison faible de la liaison de haute affinité entre les anticorps et les antigènes, après la liaison des sérums immuns. Les titres d'anticorps ont ensuite été déterminés en utilisant la procédure ELISA standard. L'indice d'avidité (AI) a été calculé en divisant le titre avec le traitement au NaSCN par le titre sans le traitement au NaSCN et en multipliant par 10056,57.

Comment citer cet article : Feng, H. et al. L'incorporation d'une cytokine modifiée ancrée au GPI en tant qu'adjuvant moléculaire améliore l'immunogénicité des VLP du VIH. Sci. Rep. 5, 11856; doi : 10.1038/srep11856 (2015).

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Nous sommes reconnaissants à Mme Ying-Chun Wang, Tamanna Ahmed et Dahnide Taylor Williams pour le soutien de laboratoire et Erin-Joi Collins pour le soutien administratif. Cette étude a été soutenue par les subventions NIH/NIAID AI10908 (RWC), AI116361 (BZW), AI093881 (JG) et le Winship Robbins Scholar Award et le Winship Melanoma Research Fund (JD).

Feng Hao et Zhang Han ont également contribué à ce travail.

Département de microbiologie et d'immunologie, Emory Vaccine Center, Emory University, Atlanta, 30322, GA, États-Unis

Hao Feng, Han Zhang, Li Wang, Yuan He, Shelly Wang, Roheila Seyedtabaei, Richard W. Compans et Bao-Zhong Wang

Département d'hématologie et d'oncologie médicale, Winship Cancer Institute, Emory University, Atlanta, 30322, GA, États-Unis

Jiusheng Deng et Jacques Galipeau

Département de bioingénierie, Université de technologie du Henan, Zhengzhou, 450052, Chine

Qing Wang et Laiting Liu

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RWC et BZW ont géré le projet. HF, LL et BZW ont conçu des expériences d'immunisation. HF, HZ, LW, YH, SW et RS ont réalisé des expériences d'immunisation. JD et JG ont effectué des analyses de fonction. QW et LL ont effectué des analyses statistiques. HF, HZ et BZW ont rédigé le manuscrit. JG, RWC et BZW ont révisé le manuscrit.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

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Réimpressions et autorisations

Feng, H., Zhang, H., Deng, J. et al. L'incorporation d'une cytokine modifiée ancrée au GPI en tant qu'adjuvant moléculaire améliore l'immunogénicité des VLP du VIH. Sci Rep 5, 11856 (2015). https://doi.org/10.1038/srep11856

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Reçu : 20 octobre 2014

Accepté : 22 mai 2015

Publié: 07 juillet 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/srep11856

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