La consolidation noradrénergique de la mémoire de reconnaissance sociale est médiée par β

May 27, 2023

Communications Biology volume 5, Article number: 1097 (2022) Citer cet article

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La mémoire de reconnaissance sociale (SRM) est essentielle pour maintenir les relations sociales et augmenter le taux de survie. Le cortex préfrontal médian (mPFC) est une zone cérébrale importante associée au stockage des SRM. La libération de noradrénaline (NE) régule l'excitabilité intrinsèque neuronale mPFC et la transmission synaptique excitatrice, cependant, les rôles de la signalisation NE dans les circuits de la voie du locus coeruleus (LC) vers le mPFC pendant le stockage du SRM sont inconnus. Ici, nous avons constaté que les projections LC-mPFC NE régulaient de manière bidirectionnelle la consolidation SRM. L'infusion de propranolol et les récepteurs β-adrénergiques (β-AR) ou l'inactivation de la β-arrestine2 dans le mPFC ont perturbé la consolidation du SRM. Lorsque le carvédilol, un β-bloquant qui peut légèrement activer la signalisation biaisée par la β-arrestine, a été injecté, les souris n'ont montré aucune suppression significative de la consolidation du SRM. La consolidation SRM altérée causée par le knock-out de β1-AR ou β-arrestin2 dans le mPFC n'a pas été sauvée en activant les projections LC-mPFC NE ; cependant, le SRM altéré par l'inhibition des projections LC-mPFC NE ou de l'inactivation de β1-AR dans le mPFC a été restauré en activant la voie de signalisation de la β-arrestine dans le mPFC. De plus, l'activation de la signalisation β-arrestine a amélioré la consolidation du SRM chez les souris âgées. Notre étude suggère que les projections LC-mPFC NE régulent la consolidation SRM par le biais de la signalisation β-AR biaisée en β-arrestine.

La mémoire de reconnaissance sociale (SRM) est essentielle pour établir et maintenir des relations sociales1, qui sont essentielles pour l'adaptation, la reproduction et la survie à l'environnement2,3. Chez les rongeurs, le SRM est évalué par la capacité à distinguer et à préférer les nouveaux congénères aux congénères familiers qui ont déjà été rencontrés. Comme pour les autres formes d'apprentissage, les informations sociales sont acquises et consolidées lorsque les traces labiles sont stabilisées dans la mémoire à long terme4. Les mécanismes sous-jacents à la consolidation des SRM ne sont pas clairs.

Le cortex préfrontal médian (mPFC) est essentiel pour un large éventail de comportements sociaux1,5. Le mPFC est inclus dans plusieurs neurocircuits cruciaux pour la mémoire sociale, notamment les circuits ventraux hippocampe-mPFC, amygdale-mPFC et olfactif-mPFC6,7,8. Les perfusions d'antagonistes des récepteurs NMDA ou AMPA/kainate dans le mPFC empêchent la consolidation du SRM9. Cette preuve suggère que la transmission synaptique glutamatergique dans le mPFC régule la capacité sociale et la mémoire de reconnaissance sociale. L'excitabilité neuronale dans le mPFC est également essentielle pour la mémoire sociale. Les neurones excitateurs du mPFC forment des ensembles distincts qui sont orientés vers l'exploration sociale et transmettent des informations sur les cibles sociales10. L'activation des neurones excitateurs dans le mPFC diminue l'exploration sociale11. L'activation chimiogénétique des neurones excitateurs mPFC chez les souris déficientes en Shank3 restaure une reconnaissance sociale réduite12. La synthèse des protéines dans le mPFC est nécessaire pour la consolidation du SRM, mais pas pour la reconnaissance sociale13. La noradrénaline (NE) est un neuromodulateur courant qui joue un rôle clé dans l'attention, la perception et la cognition14. Les neurones à noradrénaline du locus coeruleus (LC), la principale source de NE dans le système nerveux central, se projettent largement vers le cerveau antérieur, y compris le mPFC par une arborisation axonale hautement ramifiée15,16. Des enregistrements patch-clamp ont montré que la libération de NE améliore l'excitabilité intrinsèque neuronale mPFC17, qui est bloquée par l'antagoniste des récepteurs β-adrénergiques (β-AR)18. L'activation β-AR facilite également les réponses postsynaptiques des synapses excitatrices sur les neurones pyramidaux dans le mPFC19. Cependant, on ne sait pas si le système LC-mPFC NE est impliqué dans le SRM et comment la signalisation NE dans le mPFC pourrait contribuer à la consolidation du SRM.

Les β-AR sont des récepteurs couplés à la protéine de liaison aux nucléotides de guanine hétérotrimériques (protéine G) prototypes (GPCR) qui répondent à la NE. La liaison du ligand induit des changements conformationnels du GPCR qui recrutent des protéines G hétérotrimériques, conduisant à l'activation de l'adénylate cyclase. De plus, la phosphorylation dépendante du ligand du GPCR favorise le recrutement de la β-arrestine, ce qui induit une désensibilisation des récepteurs20. De plus, la β-arrestine peut agir comme une protéine d'échafaudage, initiant des voies de signalisation indépendantes des protéines G21. Nos études précédentes ont montré que la signalisation biaisée par β-AR/β-arrestine dans le cortex entorhinal médie la reconsolidation de la mémoire de reconnaissance d'objet22. Cependant, les contributions de la protéine G et de la signalisation β-AR biaisée par la β-arrestine dans la mémoire sociale restent largement inconnues.

Compte tenu des considérations ci-dessus, la présente étude s'est concentrée sur les rôles des projections noradrénergiques LC-mPFC et des β-AR et de leurs voies de signalisation en aval dans la consolidation des SRM.

Pour déterminer l'effet des projections LC-mPFC NE sur le stockage de la mémoire sociale, nous avons appliqué une tâche de mémoire de reconnaissance sociale à trois chambres bien validée23. Nous avons exprimé eNpHR3.0-EYFP ou ChR2-mCherry dans des neurones LC NE chez des souris TH-Cre et détecté des terminaisons NE dans le mPFC (EYFP+ ou mCherry+, Fig. 1a, b, g, h). L'inhibition optogénétique du terminal eNpHR3.0 + NE 24 dans le mPFC a considérablement réduit la libération de NE, tandis que l'activation optogénétique du terminal ChrimsonR + NE 24 dans le mPFC a considérablement augmenté la libération de NE (Fig. 1a – d supplémentaire). Lors de la session d'habituation, qui comprend l'exposition initiale à l'appareil à trois chambres, toutes les souris ont montré une préférence similaire pour les deux chambres extérieures. Pendant la phase d'entraînement (test de sociabilité), les souris ont passé beaucoup plus de temps à interagir avec une nouvelle souris (N) au-dessus de la cage métallique vide (E) (Fig. 1e, f supplémentaires), suggérant une sociabilité similaire entre les deux groupes. Nous avons sélectivement stimulé les projections LC-mPFC NE immédiatement après le test de sociabilité (Fig. 1a, g). Le test SRM a été effectué 1 heure ou 1 jour après que les souris ont été exposées à la nouvelle souris, et il s'agissait de comparer le temps d'interaction avec la souris maintenant familière (F) à l'interaction avec une deuxième nouvelle souris (N). L'inhibition optogénétique des projections LC-mPFC NE25 n'a pas modifié la préférence pour la nouvelle souris dans le test SRM 1 (Fig. 1c, d); cependant, cela a diminué l'indice de discrimination dans le test SRM 2 (Fig. 1e, f), ce qui suggère que les projections LC-mPFC NE sont nécessaires pour le SRM à long terme mais pas pour le SRM à court terme. De plus, dans la tâche SRM à trois chambres, nous avons constaté que l'activation optogénétique des projections LC-mPFC NE après l'entraînement n'augmentait pas l'exploration de la nouvelle souris dans le test SRM effectué 1 jour plus tard (Fig. 1i, j). Le SRM s'estompe rapidement et ne persiste que quelques jours chez la souris26. Lorsque le test SRM a été effectué 4 jours après l'entraînement, les souris témoins ont exploré les souris nouvelles et familières presque également, tandis que les souris avec activation des projections LC-mPFC NE ont montré une préférence considérablement plus grande pour la nouvelle souris que celle du groupe témoin ( Fig. 1k, l), suggérant que l'amélioration de la libération de NE dans le mPFC a prolongé le maintien de la mémoire sociale et favorisé la consolidation du SRM. L'activation des récepteurs β-adrénergiques recrute une kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK), facilitant le maintien de la potentialisation à long terme et la formation de la mémoire à long terme27. Ainsi, nous avons examiné les niveaux de pERK dans le mPFC après le test de sociabilité avec stimulation laser. Nous avons constaté que l'exposition à une nouvelle souris augmentait de manière significative les niveaux de pERK dans le mPFC par rapport aux souris exposées à une souris familière ou à la cage métallique vide (Fig. 2 supplémentaire). De plus, l'inhibition des projections LC-mPFC NE a supprimé l'activation de ERK dans le mPFC après le test de sociabilité (Fig. 1m, n). L'activation des projections LC-mPFC NE a augmenté l'activation de ERK dans le mPFC de souris naïves, mais n'a pas amélioré davantage l'activation de ERK après le test de sociabilité (Fig. 1m, o). Ces résultats indiquent que les projections LC-mPFC NE pourraient réguler la consolidation SRM par le biais de la signalisation adrénergique en aval, telle que l'activation ERK.

a, g Schéma expérimental. AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP ou AAV9-EF1α-DIO-ChR2-mCherry a été injecté dans le LC de souris TH-Cre et des fibres optiques ont été implantées bilatéralement sur le mPFC. Les projections LC-mPFC NE ont été stimulées optiquement après l'entraînement et les tests SRM ont été effectués 1 h, 1 jour ou 4 jours après l'entraînement. Un laser (590 nm, 10 mW, constamment pendant 10 min ; 473 nm, 5 mW, vingt impulsions de 5 ms à 25 Hz, toutes les 5 s pendant une durée de 5 min) a été délivré après un test de sociabilité. b, h Images représentatives de l'expression de eNpHR3.0-EYFP (b) ou ChR2-mCherry (h) dans le LC avec immunocoloration TH et pointe de fibre optique dans le mPFC. c, e, i, k Cartes thermiques du test SRM. d, f, j, l Graphique statistique du temps d'exploration pour les souris familières (F) et nouvelles (N) et scores de discrimination [EYFP : n = 12, eNPHR3.0 : n = 12. d À gauche : F souris × virus ( 1, 22) = 1,628, p = 0,215, ANOVA RM à deux facteurs ; À droite : Z = 70,000, p = 0,931, test U de Mann–Whitney. f Gauche : F souris × virus (1, 22) = 9,398, p = 0,006, ANOVA RM bidirectionnelle ; À droite : t (22) = 3,807, p < 0,001, test t de Student bilatéral. mCherry : n = 14, ChR2 : n = 12. j Gauche : souris F × virus (1, 24) = 1,860, p = 0,185, ANOVA RM bidirectionnelle ; À droite : t (24) = −1,664, p = 0,113, test t de Student bilatéral. l Gauche : souris F × virus (1, 24) = 11,904, p = 0,002, ANOVA RM bidirectionnelle ; À droite : t (24) = −3,983, p < 0,001, test t de Student bilatéral]. m Schéma expérimental. AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP ou AAV9-EF1α-DIO-ChR2-mCherry a été injecté dans le LC de souris TH-Cre. Les projections LC-mPFC NE ont été stimulées optiquement après un test de sociabilité. 15 min après le test de sociabilité, les niveaux de pERK dans le mPFC ont été examinés. n Western blots représentatifs et graphique à barres pour les niveaux de pERK dans le mPFC avec inhibition des projections LC-mPFC NE après le test de sociabilité [n = 7 pour chaque groupe. session F × virus (1, 24) = 6,863, p = 0,015, ANOVA à deux facteurs]. o Western blots représentatifs et graphique à barres pour les niveaux de pERK dans le mPFC avec activation des projections LC-mPFC NE après test de sociabilité [n = 5 pour chaque groupe. session F × virus (1, 16) = 2,807, p = 0,113, ANOVA à deux facteurs]. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 et ###p < 0,001 par rapport au groupe indiqué. Barre d'échelle : 100 μm.

Nous avons éliminé sélectivement Adrb1 ou Adrb2 dans les neurones glutamatergiques mPFC en injectant AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre dans le mPFC de souris Adrb1fl / fl ou Adrb2fl / fl (Fig. 2a – f). Dans la tâche SRM à trois chambres, les souris avec suppression partielle ou complète de β1-AR dans le mPFC ont montré une préférence réduite pour la nouvelle souris dans le test SRM (Fig. 2g – i), tandis que les souris avec suppression complète, mais pas la demi-délétion de β2-AR dans le mPFC a montré une préférence altérée pour la nouvelle souris dans le test SRM (Fig. 2j). Toutes les souris ont préféré la nouvelle souris à la cage vide lors du test de sociabilité (Fig. 3a, b supplémentaires), ce qui suggère que la suppression de β1-AR et β2-AR dans le mPFC n'a pas altéré la sociabilité. L'inactivation sélective de β1-AR dans le mPFC n'a pas affecté l'activité locomotrice (Fig. 3c supplémentaire); cependant, cela a augmenté les niveaux d'anxiété, comme en témoigne la diminution de la distance dans la zone centrale et la diminution du temps passé dans la zone centrale pendant la tâche en plein champ et le côté clair pendant la tâche de la boîte L / D (Fig. 3d supplémentaire - h). L'inactivation sélective de β2-AR dans le mPFC n'a pas eu d'impact significatif sur les niveaux de locomotion ou d'anxiété (Fig. 3i – n supplémentaire). Ces résultats ont montré que les souris avec β1-AR ou β2-AR knock-out dans le mPFC étaient incapables de démontrer la mémoire sociale, indiquant que l'expression de mPFC β-AR est nécessaire pour la consolidation du SRM.

a, d AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre a été injecté dans le mPFC de souris Adrb1fl/fl ou Adrb2fl/fl et de leurs compagnons de litière WT. b, e, c, f Images représentatives et graphiques statistiques des niveaux d'ARNm adrb1 et adrb2 dans le mPFC par FISH. [c WT : n = 4 (3729 cellules), Adrb1fl/fl : n = 4 (3503 cellules), t (6) = 31,54, p < 0,001, test t de Student bilatéral ; f WT : n = 4 (3192 cellules), Adrb2fl/fl : n = 4 (3538 cellules), t (6) = 3,543, p = 0,012, test t de Student bilatéral]. Barre d'échelle : 50 μm. g Schéma expérimental. AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre a été injecté dans le mPFC de souris Adrb1fl/fl ou Adrb2fl/fl et de leurs compagnons de litière WT et hétérozygotes. Quatre semaines plus tard, la tâche SRM a été effectuée. h Image représentative de l'expression de Cre-EGFP dans le mPFC. Barre d'échelle : 500 μm. i, j Graphiques statistiques du temps d'exploration pour les souris familières (F) et nouvelles (N) et scores de discrimination des souris avec Adrb1 ou Adrb2 knock-out dans le mPFC. [i WT : n = 13, Adrb1fl/+ : n = 10, Adrb1fl/fl : n = 11. Souris F × génotype (2, 31) = 4,085, p = 0,027, ANOVA RM bidirectionnelle ; À droite : F (2, 31) = 5,364, p = 0,01, ANOVA unidirectionnelle. j WT : n = 15, Adrb2fl/+ : n = 12, Adrb2fl/fl : n = 11. Gauche : souris F × génotype (2, 35) = 4,433, p = 0,019, ANOVA RM bidirectionnelle, droite : F (2, 35) = 4,139, p = 0,024, ANOVA à un facteur]. *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 vs groupe indiqué.

Selon les résultats ci-dessus, nous avons testé les effets du propranolol et du carvédilol, un antagoniste non sélectif des β-AR, sur la consolidation du SRM. Lorsque le propranolol a été perfusé bilatéralement dans le mPFC immédiatement après le test de sociabilité, le SRM à long terme a été significativement altéré (Fig. 3a – c), tandis que le SRM à court terme est resté intact (Fig. 4a – c supplémentaire). De plus, la perfusion de propranolol dans le mPFC après l'entraînement n'a pas altéré la consolidation de la mémoire du conditionnement de la peur (Fig. 5 supplémentaire). Contrairement aux effets du propranolol, le carvédilol, un antagoniste β-AR biaisé par la protéine G, n'a pas affecté la consolidation du SRM (Fig. 3d), ce qui suggère que la consolidation du SRM pourrait ne pas dépendre de la voie de la protéine G. Dans les tâches SRM, toutes les souris ont montré une préférence significative pour la nouvelle souris par rapport à la cage vide lors du test de sociabilité (Fig. 4b, d supplémentaires). Ces données suggèrent que l'activation de β-AR dans le mPFC est sélectivement impliquée dans la consolidation du SRM et qu'une signalisation non dépendante de la protéine G peut être nécessaire pour ce processus de mémoire.

un schéma expérimental. Un antagoniste β-AR, du propranolol (10 μg) ou du carvédilol (5 μg) a été perfusé juste après l'entraînement et des tests SRM ont été effectués 1 jour plus tard. b Image représentative de l'implantation de la canule dans le mPFC. Barre d'échelle : 500 μm. c, d Graphiques statistiques du temps d'exploration pour les souris familières (F) et nouvelles (N) et scores de discrimination [c, Véhicule : n = 15, Propranolol : n = 13. Gauche : F souris × traitement (1, 26) = 6,906, p = 0,014, ANOVA RM à deux facteurs ; À droite : t (26) = 3,507, p = 0,002, test t de Student bilatéral. d Véhicule : n = 12, carvédilol : n = 14. Gauche : souris F × traitement (1, 24) = 2,707, p = 0,113, ANOVA RM bidirectionnelle ; À droite : t (24) = −1,477, p = 0,153, test t de Student bilatéral]. e Image représentative de l'expression de Cre-EGFP dans le mPFC. AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre a été injecté dans le mPFC de souris Arrb2fl/fl et leurs compagnons de litière WT. Barre d'échelle : 100 μm. f Graphique à barres pour le niveau d'expression relative de l'ARNm Arrb2. 4 semaines après l'injection d'AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre dans le mPFC de souris Arrb2fl/fl et leurs compagnons de litière WT [n = 7 pour chaque groupe, t (12) = 4,515, p < 0,001, test t non apparié à deux queues] . g Western blots représentatifs et graphique à barres pour les niveaux de pERK dans le mPFC avec knock-out β-arrestin2 [n = 5 pour chaque groupe. F souris × session (1, 16) = 11,556, p = 0,004, ANOVA à deux facteurs]. h Graphiques statistiques du temps d'exploration pour les souris familières (F) et nouvelles (N) et scores de discrimination. [WT : n = 12, Arrb2fl/fl : n = 15. Gauche : souris F × génotype (1, 25) = 7,094, p = 0,013, ANOVA RM bidirectionnelle ; À droite : t (25) = 2,557, p = 0,017, test t bilatéral non apparié]. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 et ##p < 0,01 par rapport au groupe indiqué.

Nous proposons que la voie de signalisation de la β-arrestine dans le mPFC pourrait être impliquée dans la consolidation du SRM. Pour tester cette hypothèse, nous avons injecté AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre dans le mPFC de souris Arrb2fl / fl et éliminé sélectivement la β-arrestine2 dans les neurones excitateurs mPFC (Fig. 3e, f). L'inactivation sélective de la β-Arrestin2 dans le mPFC a considérablement réduit la préférence pour la nouvelle souris par rapport à la souris familière sans influencer la sociabilité, les niveaux d'anxiété ou l'activité locomotrice (Fig. 3h et Supplémentaire Fig. 6a – g), suggérant que l'expression de la β-arrestin2 dans le mPFC est requis pour la consolidation SRM. Les β-arrestines, qui sont en aval des GPCR, agissent comme des transducteurs de signal et interviennent dans l'activation d'un large éventail de signaux et de réponses cellulaires, y compris l'activation de ERK30,31,32. Par conséquent, nous avons examiné l'activation de ERK dans le mPFC de souris de type sauvage (WT) et β-arrestin2 knock-out après le test de sociabilité. Les résultats ont montré que le test de sociabilité augmentait de manière significative les niveaux de pERK dans le mPFC des compagnons de litière WT, mais pas chez les souris knock-out β-arrestin2 mPFC (Fig. 3g). Ces résultats indiquent que la voie de signalisation médiée par la β-arrestine joue un rôle crucial dans la consolidation du SRM.

Pour confirmer que la consolidation NEergique du SRM est médiée par les β-AR et la voie de signalisation biaisée par la β-arrestine dans le mPFC, nous avons effectué la tâche SRM avec des souris knock-out β1-AR et β-arrestin2 mPFC avec stimulation optique des terminaux LC NE dans le mPFC (Fig. 4a, b). L'inactivation sélective de β1-AR dans la consolidation SRM altérée par mPFC, qui n'a pas été sauvée par l'activation optogénétique des projections LC-mPFC NE (Fig. 4c). De plus, la consolidation altérée du SRM due à la suppression sélective de la β-arrestine2 dans le mPFC n'a pas été restaurée par l'activation des projections LC-mPFC NE (Fig. 4e). De plus, les souris WT avec des projections LC-mPFC NE activées ont montré des préférences persistantes plus élevées pour la nouvelle souris que les souris du groupe témoin, tandis que les souris avec suppression de β1-AR ou β-arrestin2 dans le mPFC ont montré une discrimination altérée de la nouvelle souris 4 jours après l'entraînement, même avec l'activation des projections LC-mPFC NE (Fig. 4d, f).

un schéma expérimental. AAV9-EF1α-DIO-ChR2-mCherry et AAV9-THP-iCre ont été injectés dans le LC, AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre a été injecté dans le mPFC et des fibres optiques ont été implantées au-dessus du mPFC de Adrb1fl/fl ou Arrb2fl /fl souris. Quatre semaines plus tard, la tâche SRM a été effectuée. Pour la stimulation des terminaux NE dans le mPFC, une lumière bleue a été délivrée (473 nm, vingt impulsions de 5 ms à 25 Hz, toutes les 5 s, durée de 5 min) après un test de sociabilité et des tests SRM ont été effectués 1 jour plus tard. b Images représentatives de l'expression de ChR2-mCherry dans le LC, de l'expression de Cre-EGFP, des terminaux ChR2-mCherry + et de la pointe de la fibre optique dans le mPFC. c–f Graphiques statistiques du temps d'exploration pour les souris familières (F) et nouvelles (N) et scores de discrimination [c, d mCherry/EGFP, n = 12 ; ChR2/EGFP, n = 11 ; ChR2/Cre, n = 13 ; mCherry/Cre, n = 12. c Gauche : F souris × virus (3, 44) = 7,961, p < 0,001, ANOVA RM bidirectionnelle ; Droite : F (3, 44) = 4,139, p < 0,001, ANOVA unidirectionnelle ; d Gauche : souris F × virus (3, 44) = 5,895, p = 0,004, ANOVA RM bidirectionnelle ; Droite : F (3, 44) = 8,928, p < 0,001, ANOVA unidirectionnelle. e, f mCherry/EGFP, n = 12 ; ChR2/EGFP, n = 13 ; ChR2/Cre, n = 13 ; mCherry/Cre, n = 12. e Gauche : souris F × virus (3, 46) = 7,304, p < 0,001, ANOVA RM bidirectionnelle ; Droite : F (3, 46) = 7,469, p < 0,001, ANOVA unidirectionnelle ; f Gauche : souris F × virus (3, 46) = 10,826, p < 0,001, ANOVA RM bidirectionnelle ; À droite : F (3, 46) = 9,586, p < 0,001, ANOVA unidirectionnelle]. g scAAV1-hSyn-FlpO a été injecté dans le LC et AAV9-EF1α-fDIO-Cre-mCherry a été injecté dans le mPFC de souris Arrb2fl/fl. Images représentatives de l'expression de Cre-mCherry dans le mPFC. h Graphiques statistiques du temps d'exploration pour les souris familières (F) et nouvelles (N) et scores de discrimination [WT : n = 11 ; Arrb2fl/fl : n = 15. Gauche : souris F × virus (1, 24) = 4,7, p = 0,04, ANOVA RM bidirectionnelle, droite : t (24) = 2,196, p = 0,038, t de Student bilatéral test]. *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 vs groupe indiqué. Barre d'échelle : 100 μm.

Des études montrent que des titres élevés d'AAV1 présentent une propagation transsynaptique antérograde33. Les injections de l'AAV1 exprimant la recombinase Cre/FlpO dans la zone cérébrale contenant les neurones présynaptiques et simultanément l'AAV avec une cassette d'expression inductible Cre/FlpO dans la zone en aval, permettent le marquage sélectif des neuons post-synaptiques innervés par la région présynaptique. Ensuite, nous avons injecté scAAV1-hSyn-FlpO antérograde avec un titre élevé dans le LC et AAV9-EF1α-fDIO-Cre-mCherry dans le mPFC de souris Arrb2fl/fl, ce qui a permis l'expression de la recombinase Cre puis l'inactivation de la β-arrestine2 dans le mPFC neurones innervés par les neurones LC adrénergiques et non adrénergiques (Fig. 4g). Les souris présentant une délétion sélective de la β-arrestine2 ont montré une préférence réduite pour la nouvelle souris, ce qui suggère que l'expression de la β-arrestine2 dans le circuit LC-mPFC est nécessaire à la consolidation du SRM (Fig. 4h). Toutes les souris ont montré une sociabilité intacte (Fig. 7 supplémentaire). Les résultats ci-dessus indiquent que la régulation de la libération de LC-mPFC NE pendant la consolidation du SRM est médiée par la signalisation β-adrénergique biaisée en β-arrestine.

Nous avons développé un vecteur de virus adéno-associé et livré le mutant R165L rM3Dq (rM3Darr)36 au mPFC pour activer pharmacologiquement la signalisation dépendante de la β-arrestine avec un traitement CNO. Nous avons d'abord confirmé l'activation de la signalisation dépendante de la β-arrestine dans les cellules N2a transfectées avec rM3Darr. Les résultats ont montré que le CNO (1 μM) augmentait significativement les niveaux de pERK 15 à 30 min après le traitement (Fig. 5a). De plus, l'inactivation de la β-arrestine2 a inhibé l'activation de ERK induite par le traitement CNO (1 μM) dans les cellules N2a avec l'expression de rM3Darr (Fig. 5b), ce qui suggère que l'activation de rM3Darr induit l'activation de ERK dépendante de la β-arrestine. Ensuite, nous avons exprimé rM3Darr-mCherry dans le mPFC et effectué une expérience SRM à trois chambres (Fig. 5c, d). Les souris traitées avec CNO (1 mg/kg, ip) immédiatement après le test de sociabilité n'ont pas montré de préférence accrue supplémentaire pour la nouvelle souris lors du test SRM réalisé 1 jour plus tard ; cependant, ils ont montré une préférence persistante pour la nouvelle souris lors du test SRM effectué 4 jours plus tard (Fig. 5e, f), suggérant que l'activation de la signalisation β-arrestin2 favorise la consolidation du SRM. Ensuite, nous avons exprimé rM3Darr-mCherry dans le mPFC et eNpHR3.0-EYFP dans les neurones LC NE et implanté des fibres optiques dans le mPFC (Fig. 5g). L'inhibition optogénétique des projections LC-mPFC NE a diminué la préférence pour la nouvelle souris, tandis que l'activation de la signalisation β-arrestine a considérablement amélioré la préférence pour la nouvelle souris (Fig. 5h), ce qui suggère que l'activation de la voie de signalisation β-arrestine a restauré le social altéré. mémoire causée par l'inhibition des projections LC-mPFC NE. De plus, nous avons simultanément exprimé rM3Darr-mCherry et supprimé β1-AR dans le mPFC (Fig. 5i). Bien que la consolidation du SRM ait été altérée par la suppression de β1-AR dans le mPFC, l'activation de la voie de signalisation de la β-arrestine a restauré la mémoire de la souris familière et augmenté la préférence pour la nouvelle souris (Fig. 5j). Toutes les souris ont préféré la nouvelle souris à la cage vide lors du test de sociabilité (Fig. 8 supplémentaire). Ces résultats suggèrent que la consolidation du SRM peut être favorisée par l'activation pharmacologique de la signalisation biaisée par la β-arrestine.

un CNO (1 μM) a augmenté significativement les niveaux de pERK 15 à 30 min après le traitement dans les cellules N2a transfectées avec rM3Darr [n = 7 pour chaque groupe, 15 min : F (5, 36) = 5,261, p < 0,001, unidirectionnel ANOVA]. b Arrb2 knockdown a inhibé l'activation de ERK par traitement CNO (1 μM) dans des cellules N2a transfectées avec rM3Darr à 15 min [n = 6 pour chaque groupe, F shRNA × traitement (1, 20) = 8,207, p = 0,010, ANOVA à deux voies ]. c Schéma expérimental. AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry et AAV9-CAG-Cre ont été injectés dans le mPFC de souris C57BL/6 J. Quatre semaines plus tard, la tâche SRM a été effectuée. Les souris ont reçu une injection de CNO (1 mg/kg, ip) après entraînement et des tests SRM ont été effectués 1 jour et 4 jours plus tard. d Image représentative de l'expression de rM3Darr-mCherry dans le mPFC. e, f Graphiques statistiques du temps d'exploration pour les souris familières (F) et nouvelles (N) et scores de discrimination [Saline, n = 13 ; CNO, n = 15. e Gauche : souris F × traitement (1, 26) = 2,29, p = 0,142, ANOVA RM à deux voies ; À droite : t (26) = −1,121, p = 0,273, test t de Student bilatéral. f Gauche : souris F × traitement (1, 26) = 7,024, p = 0,014, ANOVA RM à deux facteurs ; À droite : t (26) = −2,579, p = 0,016, test t de Student bilatéral]. g Injection de virus et images représentatives de l'expression de eNpHR3.0-EYFP dans le LC, de l'expression de rM3Darr-mCherry et de la pointe de la fibre optique dans le mPFC. AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP a été injecté dans le LC, AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry et AAV9-CAG-Cre ont été injectés dans le mPFC de souris TH-Cre. Des fibres optiques ont été implantées au-dessus du mPFC. h Graphiques statistiques du temps d'exploration pour les souris familières (F) et nouvelles (N) et scores de discrimination [EYFP/mCherry, n = 13 ; EYFP/rM3Darr, n = 12 ; eNpHR3.0/rM3Darr, n = 14 ; eNpHR3.0/mCherry, n = 13. Gauche : souris F × virus (3, 48) = 7,135, p < 0,001, ANOVA RM bidirectionnelle, droite : F (3, 48) = 8,697, p < 0,001, un -way ANOVA]. i Injection de virus et image représentative de l'expression de rM3Darr-mCherry et Cre-EGFP dans le mPFC. j Graphiques statistiques du temps d'exploration et des scores de discrimination [Saline, n = 12 ; CNO, n = 15. À gauche : F mous × traitement (1, 25) = 9,238, p = 0,005, ANOVA RM à deux facteurs ; À droite : t (25) = −3,638, p = 0,001, test t de Student bilatéral]. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 et ###p < 0,001 par rapport au groupe indiqué. Barre d'échelle : 100 μm.

Une baisse de l'apprentissage déclaratif et des performances de la mémoire est un phénomène courant associé au vieillissement37. Nos résultats montrent que la consolidation du SRM est altérée chez les souris âgées (> 18 mois, Fig. 6a, b). Ainsi, nous avons exprimé rM3Darr-mCherry dans le mPFC de souris âgées (Fig. 6c). Les données ont montré que le traitement au CNO (1 mg / kg, ip) après le test de sociabilité augmentait de manière significative la préférence pour la nouvelle souris dans le test SRM (Fig. 6d). Toutes les souris ont préféré la nouvelle souris à la cage vide lors du test de sociabilité (Fig. 9 supplémentaire). Ces données suggèrent que la signalisation biaisée par β-AR/β-arrestine pourrait être une cible médicamenteuse potentielle pour améliorer la mémoire sociale chez les personnes âgées.

un schéma expérimental. La tâche SRM a été réalisée chez des souris âgées (> 18 mois). b Graphiques statistiques du temps d'exploration et des scores de discrimination [Jeune adulte, n = 12 ; Âgé, n = 11. À gauche : souris F × âge (1, 21) = 9,816, p = 0,005, ANOVA RM à deux facteurs ; À droite : Z = 33,000, p = 0,045, test U de Mann–Whitney]. c Image représentative de l'expression de rM3Darr-mCherry dans le mPFC. AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry et AAV9-CAG-Cre ont été injectés dans le mPFC de souris âgées (> 18 mois). d Graphiques statistiques du temps d'exploration pour les souris familières (F) et nouvelles (N) et scores de discrimination [Saline, n = 11 ; CNO, n = 12. Gauche : souris F × traitement (1, 21) = 4,979, p = 0,037, ANOVA RM bidirectionnelle, droite : t (21) = −2,95, p = 0,008, test t de Student bilatéral ]. e Modèle de travail illustrant que les projections LC-mPFC NE régulent la consolidation de la mémoire de la reconnaissance sociale par le biais d'une signalisation biaisée en β-arrestin2. *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 vs groupe indiqué. Barre d'échelle : 100 μm.

Dans cette étude, nous avons constaté que les projections LC-mPFC NE contrôlaient la consolidation du SRM via une signalisation biaisée par β-AR / β-arrestine dans le mPFC (Fig. 6e). L'activation des projections LC-mPFC NE ou de la signalisation β-arrestine a favorisé le maintien de la mémoire sociale. De plus, l'altération de la consolidation du SRM causée par l'inhibition de la projection NE ou la suppression de β1-AR dans le mPFC a été restaurée en activant la signalisation biaisée par la β-arrestine.

La tâche à trois chambres est un paradigme de test largement utilisé pour mesurer quantitativement la sociabilité et la mémoire sociale38,39. La souris choisit d'entrer dans l'une des trois chambres ; ainsi, la sociabilité peut être mesurée en comparant directement la préférence pour une nouvelle souris à la préférence pour une cage câblée vide. Avec cette tâche, la mémoire de reconnaissance sociale peut également être évaluée en comparant les interactions avec une nouvelle souris aux interactions avec des souris familières dans chaque chambre. Cependant, on ne sait toujours pas si les souris préfèrent la nouveauté sociale ou simplement la nouveauté dans la cage câblée. Il est possible que les souris ne se soucient que du fait que la cage précédemment vide contient maintenant quelque chose ou une nouvelle souris.

Nos données ont montré que l'injection de propranolol, un antagoniste β-adrénergique, ou l'élimination de β-AR dans le mPFC altérait significativement la consolidation du SRM, tandis que l'injection de carvédilol, un antagoniste non sélectif biaisé par la protéine β-AR G et un antagoniste α1-AR, induit pas une telle déficience. Les effets distincts du propranolol et du carvédilol suggèrent que le β-AR, mais pas l'α1-AR, dans le mPFC participe au processus de consolidation du SRM. De nombreuses études ont montré que l'α2-AR dans le mPFC est impliqué dans la mémoire de travail, aboutissant à des conclusions différentes. Certaines études ont rapporté que l'activation de l'α2-AR altère les fonctions du mPFC, telles que les performances de la mémoire de travail37,40. Cependant, d'autres études ont rapporté que les agonistes α2 adrénergiques améliorent les fonctions du cortex préfrontal, y compris la mémoire de travail41,42. De plus, il a été démontré que l'administration d'un antagoniste α2-adrénergique (qui augmente les concentrations de NE) améliore la reconnaissance sociale43. En raison des expressions différentielles des récepteurs adrénergiques α et β dans les neurones pyramidaux et les interneurones, les différents rôles de α-AR et β-AR dans le mPFC dans la consolidation de la mémoire de reconnaissance sociale doivent être étudiés plus avant.

Lors de la liaison au ligand, les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR), y compris les β-AR, subissent des changements conformationnels qui favorisent leur liaison aux protéines G hétérotrimériques et aux β-arrestines. Des études récentes ont indiqué que les protéines G hétérotrimériques et les β-arrestines sont toutes deux capables d'interagir indépendamment avec et de recruter des molécules de signalisation intracellulaires44,45. La plupart des ligands qui se lient aux GPCR ont une activité de signalisation équilibrée ou non biaisée via les protéines G et les β-arrestines. Certains ligands avec une préférence pour une voie par rapport aux autres voies ont également été découverts. Le carvédilol est un antagoniste β-AR biaisé par la protéine G qui active légèrement la signalisation β-arrestine. Le propranolol est un antagoniste complet qui bloque à la fois les voies de la protéine G et de la β-arrestine. Des études antérieures ont montré que le carvédilol favorise sélectivement le recrutement de Gαi en β1-AR, activant la voie biaisée par β-arrestin228,46 et induisant la transactivation médiée par β1-AR de l'EGFR et l'activation de ERK dépendante de β-arrestin230, suggérant que β -arrestin2 peut médier la signalisation β1-AR indépendamment. Il a longtemps été postulé que la voie de signalisation conventionnelle protéine G/cAMP/PKA médie le rôle des β-AR dans la mémoire. Des études antérieures ont montré que le blocage de la transmission β-AR avec du propranolol altère la consolidation ou la reconsolidation de la mémoire pendant le conditionnement de la peur, la reconnaissance d'objets et la CPP induite par la cocaïne42,47,48. L'inhibition des activités de certains composants des voies couplées aux protéines G, telles que PKA et CREB, perturbe la consolidation et la reconsolidation de la mémoire49,50. Cependant, la reconsolidation de la mémoire nécessite la synthèse de protéines mais pas l'activation de PKA51. Nos études précédentes ont suggéré que la signalisation biaisée par la β-arrestine dans le cortex entorhinal médie la reconsolidation de la mémoire de reconnaissance d'objet22, suggérant que la voie de signalisation dépendante de la β-arrestine devrait jouer un rôle dans le stockage de la mémoire. Dans cette étude, le carvédilol n'a pas supprimé le SRM dans le test de rétention de la mémoire 1, contrairement au propranolol, ce qui suggère que la consolidation du SRM après l'entraînement pourrait ne pas dépendre d'une voie biaisée par la protéine G. De plus, les souris avec β-arrestin 2 knock-out dans le mPFC ont montré une consolidation SRM altérée. Lorsque la voie de signalisation β-arrestine a été activée après l'entraînement, le maintien du SRM a été favorisé et la consolidation altérée du SRM causée par l'inhibition des projections LC-mPFC ou la suppression de β1-AR a été sauvée. Ainsi, nous proposons que la régulation des projections LC-mPFC NE pourrait réguler la consolidation des SRM via des voies de signalisation biaisées en β-arrestine dans le mPFC.

Des études antérieures ont indiqué que les animaux âgés présentent des niveaux d'interaction significativement réduits avec de nouvelles souris juvéniles lors de tâches sociales, même en l'absence de déclin cognitif manifeste, ce qui suggère que les circuits sociaux sont particulièrement vulnérables au cours du vieillissement. Il a été rapporté depuis longtemps que les neurones LC sont considérablement réduits chez les personnes âgées54 et les animaux que chez les jeunes55, ce qui pourrait contribuer aux problèmes de mémoire sociale chez les souris âgées. Dans cette étude, nous avons constaté que l'activation directe de la signalisation β-arrestine en stimulant les neurones exprimant rM3Darr dans le mPFC augmentait de manière significative l'exploration préférentielle chez les souris âgées. Ainsi, notre étude démontre que la signalisation biaisée par la β-arrestine est essentielle pour le stockage des SRM.

Le concept de biais de ligand dans la signalisation en aval du GPCR a récemment attiré de plus en plus d'attention. Plusieurs ligands biaisés ont un potentiel clinique, y compris les ligands biaisés en β-arrestine du récepteur de l'angiotensine II de type 1 (AT1R)56, les ligands biaisés en protéine G du récepteur μ-opioïde (MOR)57 et les ligands biaisés en β-arrestine du récepteur dopaminergique D258. Cependant, le nombre de ligands biaisés qui ont été rapportés dans la littérature est encore limité. Nos résultats suggèrent que la signalisation biaisée par β-AR / β-arrestine est essentielle pour le stockage des SRM, démontrant le potentiel de développement de nouveaux agonistes β-AR avec une activation spécifique biaisée par β-arrestine pour l'amélioration de la mémoire.

Notre étude suggère que les projections LC-mPFC NE régulent la consolidation de la mémoire de reconnaissance sociale par les voies de signalisation biaisées par β-AR / β-arrestine, fournissant des preuves des fonctions neurobiologiques de la voie biaisée par β-arrestine dans le stockage de la mémoire. Ces données indiquent que les ligands β-adrénergiques biaisés en β-arrestine peuvent être une cible médicamenteuse potentielle pour améliorer le stockage de la mémoire et traiter les maladies psychologiques.

Des souris mâles transgéniques Adrb1fl/fl et Adrb2fl/fl ont été développées par notre laboratoire et rétrocroisées plus de 10 fois avec la souche C57BL/6J (Adrb1 : ENSMUSE000000000294435 ; Adrb2 : ENSMUSE00000399288). Arrb2fl/fl ont été gracieusement fournis par le professeur Pei Gang (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences). Les souris TH-Cre ont été achetées auprès de Jackson Laboratory (numéro de stock : 008601). Des souris mâles C57BL/6J âgées de cinq semaines ont été achetées au Shanghai Laboratory Animal Center, CAS. Toutes les souris ont été logées en groupe avec 3 à 4 par cage sous un cycle lumière-obscurité de 12 h (lumière allumée de 20 h 00 à 8 h 00) avec accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Des souris adultes (8 à 10 semaines) et des souris âgées (> 18 mois) ont été utilisées. Tous les tests comportementaux ont été effectués pendant leur période d'extinction. Tous les traitements des animaux étaient strictement conformes au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et ont été approuvés par le Animal Care and Use Committee du Shanghai Medical College de l'Université Fudan. Les descendants ont été génotypés en utilisant les ensembles d'amorces suivants : 5'-CGTTTCGCATCGGAATGAAGC-3' ; 5'-TGACGTCATGAACTGGGATTTCAG-3' (souris Adrb1fl/fl); 5'-TTGCCGCAGTCTGAAGAAGC-3'; 5′-AGGAAGGATTGTCTCCCAGTATGAC-3′ (souris Arrb2fl/fl); 5'-GGTTGCACAGCAGCCCTAGAT-3'; 5'-CCGTTATTGGCACCAGACTTTAGG-3' (souris Adrb2fl/fl); 5'-GAGACAGAACTCGGGACCAC-3'; 5'-AGGCAAATTTTGGTGTACGG-3' (souris TH-Cre). Tous les sujets comportementaux ont été individuellement habitués à l'expérimentateur au moins pendant 3 jours.

Le propranolol [(+/-)-propranolol HCl] (Sigma-Aldrich, #P0884-1G) a été dissous dans une solution saline. Le carvédilol (Tocris Bioscience, #2685) a été dissous dans une solution saline contenant 1 % de diméthylsulfoxyde. Le propranolol (10 μg) ou le carvédilol (5 μg) a été perfusé bilatéralement dans le mPFC. Le N-oxyde de clozapine [CNO] (Sigma-Aldrich, #C0832-5MG) a été dissous dans une solution saline. Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de CNO (1 mg/kg, ip).

Le vecteur pcDNA3.1 portant rM3Darr a été fourni par le professeur Ken-ichiro Nakajima qui a généré cette construction contenant M3 avec la mutation ponctuelle R165L. AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry a été développé pour activer sélectivement la signalisation biaisée par la β-arrestine sans perturber les voies médiées par la protéine G en réponse au traitement par CNO comme décrit précédemment36. La séquence Cre de pCAG-Cre-GFP (Addgene Plasmid # 13776) a été clonée dans pAAV2-THP-EGFP (Addgene Plasmid # 80336) via les sites d'enzymes de restriction ECOR I et Sali. AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre, AAV9-mCaMKIIα-EGFP, AAV9-EF1α-Flex-ChrimsonR-tdTomato, AAV9-THP-Cre, scAAV1-hSyn-FlpO et AAV9-EF1α-fDIO-Cre-mCherry ont été emballés par Taitool Biological Co., Ltd. AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP, AAV9-EF1α-DIO-EYFP, AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry, AAV9-hSyn-DIO-mCherry, AAV9-hSyn- NE2h-EGFP et AAV9-CAG-Cre ont été conditionnés par Neuron Biotech Co., Ltd. AAV9-EF1α-DIO-hChR2(H134R)-mCherry et AAV9-EF1α-DIO-mCherry ont été conditionnés par BrainVTA Co., Ltd. Des titres d'AAV allant de 2,0 × 1012 à 2,5 × 1012 génome de vecteur (vg) ml-1 ont été utilisés dans toutes les expériences. Un titre élevé de scAAV1-hSyn-FlpO (1 × 1013 vecteur génome (vg) ml-1) a été appliqué pour une infection antérograde.

Les souris ont été anesthésiées à l'isoflurane (3,5 % d'induction, 1,5 à 2 % d'entretien) et placées dans un appareil stéréotaxique (Stoelting Instruments, USA). Le virus a été infusé dans le mPFC (de bregma : antéro-postérieur (AP), + 1,8 mm ; médiolatéral (ML), ± 0,30 mm ; et dorso-ventral (DV), -2,5 mm), ou le LC (AP, -5,4 mm ; ML, ± 0,85 mm ; et DV, -4,0 mm). Le virus a été délivré à l'aide d'une seringue de 10 μl et d'une aiguille émoussée de calibre 36 sous le contrôle d'une ultra micro pompe UMP3 (World Precision Instruments, USA) avec un volume et un débit contrôlés (150 nl à 50 nl/min). Après l'injection, l'aiguille a été laissée pendant 10 minutes supplémentaires et a ensuite été retirée lentement. Les fibres optiques (0,37 NA, diamètre de cœur de 200 μm ; Anilab) ont été implantées au-dessus du mPFC (AP, +1,9 mm ; ML, ±1,1 mm ; et DV, -2,4 mm, angle de 20°). Après la chirurgie, les souris ont pu récupérer pendant au moins trois semaines avant les expériences comportementales.

Les souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane (3,5 % d'induction, 1,5 à 2 % d'entretien) et placées dans un appareil stéréotaxique. Les canules de guidage du socle de médicament (calibre 27, RWD Life Science Co. Ltd.) ont été implantées bilatéralement à 1 mm au-dessus du mPFC (AP, + 1, 9 mm; ML, ± 1, 1 mm; et DV, -1, 4 mm, angle de 20 °). Les animaux ont été autorisés à récupérer de la chirurgie pendant au moins 2 semaines avant les tests comportementaux. Une aiguille en acier de calibre 34 avec une saillie de 1,0 mm a été connectée à une pompe à perfusion (BAS Bioanalytical Systems Inc.). Le propranolol (10 μg), le carvédilol (5 μg) ou une solution saline a été perfusé via la canule guide bilatéralement après un test de sociabilité à 3 chambres ou un conditionnement de la peur.

Les animaux ont été perfusés par voie transcardiaque avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans un tampon de phosphate de sodium 0,1 M (PB), puis post-fixés pendant 4 h. Les cerveaux ont été cryoprotégés avec 30 % (wt/vol) de saccharose/solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant au moins 48 h et les tranches ont été sectionnées à 30 μm par un vibratome (CM3050S, Leica). Les tranches ont été bloquées avec 10 % de sérum de chèvre normal dans du PBS avec 0,3 % de Triton X-100 (PBST), puis incubées avec des anticorps primaires contre TH59 (souris ; 1:1000 ; Millipore AB152), RFP60 (lapin, 1:500 ; Rockland, 600-401-379) ou GFP61 (poulet, 1 : 500 ; Thermo Fisher Scientific, A-10262), dans du PBST à 4 °C pendant la nuit. Les sections ont été rincées trois fois avec du PBS pendant 15 minutes chacune à température ambiante (RT), suivies d'une incubation d'anticorps secondaire [Alexa-488 ou Cy3 IgG (souris, lapin ou poulet, 1:50 000, Jackson ImmunoResearch)] dans du PBST à TA pendant 2h. Les coupes ont ensuite été rincées trois fois avec du PBS pendant 15 minutes chacune puis montées sur des lames. Les images ont été visionnées et photographiées avec le Nikon A1 confocal en utilisant des objectifs ×10 ou ×20.

La tâche de comportement social a été réalisée dans un appareil à trois chambres, une boîte rectangulaire en plexiglas non transparent (40 cm de longueur × 63 cm de largeur × 23 cm de hauteur). La boîte était divisée par deux parois en plexiglas avec une petite porte circulaire (7 cm de diamètre). Deux chambres extérieures (40 cm de longueur × 21 cm de largeur × 23 cm de hauteur) étaient reliées par une chambre centrale (40 cm de longueur × 21 cm de largeur × 23 cm de hauteur). Le test SRM a été réalisé après la séance d'habituation et le test de sociabilité10.

La souris sujet a été libérée dans le compartiment du milieu et autorisée à explorer la boîte à trois chambres avec un conteneur de fil vide dans chaque chambre extérieure pendant 10 min pendant 3 jours consécutifs.

Le quatrième jour, une souris mâle juvénile (nouvelle souris, âgée de 3 à 5 semaines), qui n'avait eu aucun contact préalable avec la souris sujet, a été introduite dans une cage câblée dans une chambre désignée comme le compartiment "social". Pendant ce temps, une cage métallique identique restée vide a été placée dans l'autre chambre. La souris sujet a été libérée dans la chambre du milieu et autorisée à explorer les trois chambres pendant deux essais de 10 minutes, avec un intervalle de 15 minutes entre les essais. Le temps que les souris ont exploré dans un rayon de 2 cm à proximité de chaque cage métallique (approche, support, montage en reniflant et temps de contact nez à nez) a été compté.

Les tests SRM ont été effectués 1 h, 1 jour ou 4 jours après les tests de sociabilité, et la souris sujet a été relâchée dans la chambre du milieu pendant 10 min. Au cours du test de rétention de la mémoire, une chambre contenait une cage grillagée avec une souris mâle étrangère juvénile (nouvelle souris, âgée de 3 à 5 semaines) et l'autre chambre contenait une cage grillagée avec la souris familière précédemment exposée au test de sociabilité (souris familière). Ainsi, la souris familière est la même que celle utilisée dans le test de sociabilité et la nouvelle souris est différente dans chaque test SRM. Encore une fois, l'emplacement de la nouvelle souris et de la souris familière a été contrebalancé entre les sessions. La cage métallique a été soigneusement nettoyée avant et entre les essais. Toutes les séances ont été enregistrées avec une caméra vidéo numérique. Le temps pendant lequel les souris ont exploré les souris familières et nouvelles au cours de chaque session a été analysé avec le logiciel Ethovision XT (Noldus, Wageningen, Pays-Bas).

Le score de discrimination de sociabilité (Eq. 1) a été calculé comme suit :

Le score de discrimination de la mémoire sociale (Eq. 2) a été calculé comme suit :

La stimulation optogénétique a été délivrée immédiatement après le test de sociabilité (3 à 4 semaines après l'infusion du virus et l'implantation de la fibre optique). Les fibres optiques ont été connectées à un laser 473 nm (lumière bleue) ou 590 nm (lumière jaune) (Shanghai Dream Lasers Technology Co. Ltd.) via un cordon de raccordement avec une paire de connecteurs FC/PC et une fibre optique 1 × 2 joint tournant. Pour la stimulation de ChR2, une lumière bleue a été délivrée à 5 mW avec vingt impulsions de 5 ms à 25 Hz, toutes les 5 s pendant une durée de 5 min. Pour la stimulation de eNpHR3.0, une lumière jaune a été délivrée en permanence à 10 mW pendant 10 min. La sortie de lumière laser à travers les fibres optiques a été ajustée par une console de wattmètre numérique et modulée avec un stimulateur d'impulsions Master 8 (AMPI).

Les virus AAV9-EF1α-Flex-ChrimsonR-tdTomato ou AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP et AAV9-hSyn-NE2h-EGFP ont été injectés individuellement dans le LC et le mPFC. Une fibre optique (200 μm de diamètre, 0,48 ouverture numérique (NA), Hangzhou Newdoon Technology) a été implantée unilatéralement dans le mPFC. Des enregistrements photométriques ont été effectués après l'infusion du virus et l'implantation de la fibre optique 3 à 4 semaines. Pour la photostimulation optogénétique, les fibres optiques ont été connectées à un laser 590 nm (lumière jaune) (Thinker Tech Nanjing Biotech) via un cordon de raccordement. Pour la stimulation des terminaux ChrimsonR + NE dans le mPFC, une stimulation optique (590 nm, 5 mW, impulsions de 5 ms à 5, 25 et 50 Hz, durée de 1 s) a été délivrée toutes les 15 s pendant 15 à 20 essais via une fibre optique implanté dans le mPFC. Pour la stimulation des terminaux eNpHR3.0 dans le mPFC, une stimulation optique (590 nm, 10 mW, durée de 10 s) a été administrée toutes les 15 s pendant 15 à 20 essais via une fibre optique implantée dans le mPFC. Dans le même temps, la dynamique de fluorescence du capteur NE, NE2h62, a été enregistrée via la même fibre optique implantée dans le mPFC. La photométrie des fibres a été effectuée de la même manière qu'auparavant. En bref, le capteur NE a été excité à l'aide de deux sources d'excitation correspondant à une lumière LED de longueur d'onde de 470 nm et de longueur d'onde de 405 nm. La lumière passait à travers des filtres d'excitation sur un câble de raccordement à fibre optique qui était connecté à la fibre implantée de manière chronique. L'intensité lumineuse à l'extrémité du câble patch était d'environ 0,25 mW. La lumière d'émission du capteur NE est revenue à travers les mêmes fibres sur un photorécepteur. Les signaux de tension analogiques ont été numérisés à 100 Hz et enregistrés à l'aide du logiciel Fiber photometry (Thinker Tech Nanjing Biotech). Les données ont été segmentées en fonction des événements de stimulation optique au sein des essais individuels. Les scores Z des 2 s avant la stimulation ont été pris comme référence. Les données de photométrie ont été analysées avec des codes MATLAB personnalisés (MATLAB R2019a, MathWorks).

Pour la tâche de conditionnement de la peur, les souris ont été introduites dans la chambre de conditionnement (Med Associates) pendant 3 min. Un jour plus tard, les souris ont été remises dans la chambre et ont reçu trois paires de tonalité-coup de pied (tonalité : 2 800 Hz, 85 dB, 30 s ; FS : 0,5 mA, 1 s) avec un intervalle entre les essais de 2 minutes. Vingt-quatre heures plus tard, un test contextuel de mémoire de peur a été effectué et les souris ont été exposées à la chambre de conditionnement pendant 3 minutes sans ton. Une autre cohorte de souris a été menée avec un test de mémoire de peur indicée avec 3 essais de tonalité (2800 Hz, 85 dB, 30 s) avec des intervalles de 30 secondes dans un nouveau contexte. Le pourcentage de temps passé à congeler a été automatiquement analysé par un programme informatique (Med Associates).

Le test OF est l'une des méthodes les plus fréquemment utilisées pour évaluer l'activité locomotrice et les niveaux d'anxiété innée des rongeurs. Deux jours avant les tests, les souris ont été autorisées à s'habituer à l'environnement où le test OF a été effectué. L'activité locomotrice a été mesurée dans une arène en plein champ (40 × 40 cm) pendant 30 min sous une luminance de 25 Lux. L'appareil a été nettoyé avant et entre les essais. La distance totale, la distance et la durée dans la zone centrale ont été analysées à l'aide d'un système de détection automatisé (TopScan, CleverSys. Inc.).

La boîte L/D (46 × 27 × 30 cm) était en plexiglas et se composait de deux compartiments. La plus grande section était le compartiment lumineux (les deux tiers de la boîte) et la plus petite section était le compartiment sombre (un tiers de la boîte). Le test a été réalisé avec une luminance de 25 Lux dans la boîte à lumière. Les souris ont été libérées du centre de la boîte à lumière avec leur dos à l'entrée et autorisées à explorer l'appareil pendant 6 min. La boîte L/D a été nettoyée avant et entre les essais. Le temps passé dans le compartiment obscur a été analysé à l'aide d'un système de détection automatisé (TopScan, CleverSys. Inc.).

Le labyrinthe O surélevé se composait de deux bras ouverts et de deux bras fermés avec des murs sur le côté. La hauteur du labyrinthe O était de 100 cm du sol. Les souris ont été placées au centre du bras ouvert et ont été autorisées à explorer pendant 6 min. Le labyrinthe O a été nettoyé avant et entre chaque sentier. Le temps passé dans chaque bras a été analysé avec le logiciel Clever System (TopScan, CleverSys. lnc.).

Les souris ont d'abord été perfusées par voie intracardiaque avec une solution saline, puis avec du paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon Na2HPO4/NaH2PO4 0,1 M (pH = 7,5), et les cerveaux ont été prélevés. Après post-fixation dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 4 h, les échantillons ont été stockés dans du saccharose à 30 %/PBS pendant 3 jours. La FISH a été réalisée sur des tranches de cerveau congelées fixes de 10 μm d'épaisseur, en suivant les procédures RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Inc., Newark, CA, USA). En bref, des sections congelées (10 µm d'épaisseur) ont été coupées coronairement à travers la formation de mPFC. Les coupes ont été décongelées sur des lames de microscope Superfrost Plus (Fisher Scientific, Waltham, États-Unis) et prétraitées pour la digestion des protéases pendant 10 min à température ambiante. Les coupes ont ensuite été incubées avec des sondes de souris Adrb1 et Adrb2 (Adrb1, numéro d'accession : NM_007419.2, région cible 158–1830 ; Adrb2, numéro d'accession : NM_007420.3, région cible 55–962) pendant 2 h à 40 °C avec mélange de sondes marquées par lame. La sonde non spécifiquement hybridée a été retirée en lavant les sections dans un tampon de lavage 1 × à température ambiante, suivi de l'amplificateur 1-FL pendant 30 min, de l'amplificateur 2-FL pendant 30 min et de l'amplificateur 3-FL pendant 15 min à 40 ° C. Chaque amplificateur a été retiré par lavage avec un tampon de lavage 1X pendant 2 min à température ambiante. Les lames ont été visualisées, analysées et photographiées avec un microscope LSM 510 (Zeiss).

Le virus AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre a été injecté dans le mPFC de souris Arrb2fl/fl et leurs compagnons de litière WT. Quatre semaines plus tard, le mPFC a été disséqué sur de la glace immédiatement avec Maxtrix pour souris (Plastic one Inc). L'ARN total a été extrait du mPFC de souris Arrb2fl/fl et WT à l'aide du réactif TRIzol® (Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, USA). La transcription inverse avec des amorces aléatoires a été réalisée selon le système Hiscript QRT SuperMix (Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd) dans un programme de cycle consistant en 2 min à 42 °C, 15 min à 50 °C, 2 min à 85 °C . La PCR quantitative a été réalisée en trois exemplaires avec ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd) par un thermocycleur PCR en temps réel (Eppendorf realplex2 Mastercycler ep realplex, Allemagne). Les amorces pour l'ARNm de CKO Arrb2 ont été conçues pour flanquer l'exon 2 (5'-GGGAGGGGAAGGAGGAGAAA-3' et 5'-TGCAGTTAGGGCTCGACTTC-3'). Les amorces pour l'ARNm de WT Arrb2 ont été conçues dans l'exon 2 (5'-GGGAGGGGAAGGAGGAGAAA-3' et 5'-TGCAGTTAGGGCTCGACTTC-3'). Les amorces pour GAPDH sont 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' et 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'.

Des cellules de neuroblastome de souris (N2a) ont été gracieusement fournies par le professeur Pei Gang (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences). Les cellules N2a ont été étalées à raison de 20 000 cellules par puits dans des plaques à 12 puits. Après 20 h, les cellules ont été transfectées de manière transitoire avec AAV-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry/CAG-cre et β-arrestin2-shRNA avec le réactif de transfection Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Environ 48 h plus tard, les cellules ont été incubées pendant une nuit dans un milieu sans sérum avant la stimulation du CNO (1 μM). Ensuite, les cellules ont été récoltées par un tampon de lyse Ripa (Beyotime, # P0013B) sur de la glace.

Les souris expérimentales ont été logées en groupe avec des souris juvéniles pendant 3 jours. Lors des tests de sociabilité, les souris ont été exposées aux trois chambres contenant une cage grillagée avec une souris familière ou nouvelle. Pour le contrôle des tests de sociabilité, les souris ont été hébergées en homecage avec ou sans stimulation optique. Les souris ont été sacrifiées 15 min après le test de sociabilité avec ou sans stimulation optique. Une tâche SRM standard à trois chambres a été réalisée dans une autre cohorte de souris qui a été sacrifiée 15 min après le test de sociabilité suivi d'une stimulation au laser. Les cerveaux ont été prélevés immédiatement et des échantillons de tissus du mPFC ou des échantillons de protéines cellulaires ont été homogénéisés avec un tampon de lyse contenant 1,0 μM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (Beyotime, # P0013B), incubés sur de la glace pendant 30 min et centrifugés à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C. La concentration en protéines a été déterminée par dosage BCA (Thermo Fisher Scientific, #23227). Chaque échantillon a été ajusté à une concentration finale en protéines de 2 μg/μl, mélangé avec un tampon de charge SDS 6 × (Beyotime, # P0015F) et bouilli pendant 10 min à 95 °C. Les échantillons ont été chargés sur une électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécylsulfate de sodium à 10 % (SDS-PAGE). Les protéines ont été transférées par électrophorèse des gels vers des membranes de nitrocellulose (NC) (Whatman) qui ont ensuite été incubées avec les anticorps primaires suivants : anti-pERK63 (dilution 1:1000, #9101 S, Cell Signaling Technology), anti-ERK63 (1:2000 , #4696 S, Cell Signaling Technology) à 4 °C pendant la nuit. Les membranes ont été rincées dans une solution saline tamponnée au Tris avec 0,1 % de Tween-20 (TBST) pendant 15 min pendant trois fois, puis incubées avec IRDye 700DX ou 800DX conjugué anti-lapin ou anti-souris immunoglobuline G (IgG) (1:50 000 ; Rockland Immunochemicals Inc.) pendant 1,5 h à température ambiante. Les bandes de protéines ont été visualisées à l'aide d'Odyssey (LI-COR Biosciences). Les immunoblots ont été analysés avec le logiciel Image J. Le niveau de phosphorylation de ERK a été calculé en normalisant l'intensité de pERK à l'expression totale de ERK.

Les données expérimentales ont été présentées sous forme de moyenne ± sem et tracées avec GraphPad Prism. Les données des tests comportementaux ont été analysées par le test t de Student bilatéral, l'analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) ou l'ANOVA bidirectionnelle avec des mesures répétées suivies du test post hoc de Bonferroni avec des sessions comme facteur intra-sujets et AAV comme un facteur inter-sujets. L'enregistrement photométrique a été analysé avec le test t de Student bilatéral ou l'ANOVA unidirectionnelle pour les transitoires de fluorescence. Les données d'immunofluorescence ont été analysées par le test t de Student bilatéral. Les données de Western blot ont été analysées par ANOVA à deux voies. Les données non normalisées ont été analysées avec le test U de Mann-Whitney et l'ANOVA unidirectionnelle de Kruskal-Wallis sur les rangs. Des analyses statistiques complètes correspondant à chaque ensemble de données sont présentées dans les données supplémentaires 1. Toutes les expériences ont été répliquées indépendamment chez 4 à 15 souris, comme indiqué sur la figure. Lorsque cela était possible, les données ont été recueillies à l'aide de répliques biologiques (tranches multi-cerveau par animal analysées pour des expériences d'hybridation in situ). Nos tailles d'échantillons ont été estimées sur la base d'expériences antérieures et sont similaires à celles généralement employées sur le terrain.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données nécessaires pour évaluer les conclusions de l'article sont présentes dans l'article et/ou le matériel supplémentaire. La Fig. 10 supplémentaire contient des versions non recadrées de tous les transferts du papier. Les données supplémentaires 2 contiennent des valeurs de données source sous-jacentes aux Figs. 1d, f, j, l, n, o, 2c, f, i–j, 3c–d, f–h, 4c–f, h, 5a, b, e–f, h, j et 6b, d .

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Nous remercions le Dr Gang Pei (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences) pour les souris Arrb2fl/fl et le Dr Ken-ichiro Nakajima pour la construction M3 mutante R165L. Cette recherche a été soutenue par le projet Science Technology Innovation 2030 de Chine (2021ZD0203500 à FW et LM, 2021ZD0202104 à XL), la National Natural Science Foundation of China Grants (32171041 à XL, 31930046 à LM, 82021002 à LM), le CAMS Innovation Fund pour les sciences médicales (2021-I2M-5-009 à LM et XL), le projet majeur de science et technologie municipales de Shanghai (2018SHZDZX01 à LM), ZJ Lab et Shanghai Center for Brain Science and Brain-Inspired Technology, et Chinese Postdoctoral Science Foundation (2021M690684 à CC).

École des sciences médicales fondamentales, Laboratoire d'État clé de neurobiologie médicale, MOE Frontiers Center for Brain Science, Institutes of Brain Science, Department of Neurology, Pharmacology Research Center, Huashan Hospital, Fudan University, 200032, Shanghai, Chine

Deqin Cheng, Junwen Wu, Enhui Yan, Xiaocen Fan, Feifei Wang, Lan Ma et Xing Liu

Unité de recherche sur la mémoire des dépendances, Académie chinoise des sciences médicales (2021RU009), 200032, Shanghai, Chine

Deqin Cheng, Junwen Wu, Enhui Yan, Xiaocen Fan, Feifei Wang, Lan Ma et Xing Liu

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DC, XL et LM ont planifié les expériences. DC et JW ont effectué les tests comportementaux. DC et EY ont réalisé les expériences de chirurgie stéréotaxique et de biochimie. DC a contribué à la culture cellulaire et aux expériences de Western Blot. XF a effectué le test FISH. DC, EY, JW et FW ont analysé les données. DC et XL ont rédigé le manuscrit. XL et LM ont révisé le manuscrit.

Correspondance avec Lan Ma ou Xing Liu.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Felix Leroy, Steven (A) Thomas et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Éditeurs principaux : Christian Wozny et George Inglis. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Cheng, D., Wu, J., Yan, E. et al. La consolidation noradrénergique de la mémoire de reconnaissance sociale est médiée par une signalisation biaisée en β-arrestine dans le cortex préfrontal de la souris. Commun Biol 5, 1097 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04051-y

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Reçu : 14 mars 2022

Accepté : 28 septembre 2022

Publié: 17 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04051-y

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