Les projections préfrontales vers le noyau reuniens signalent la pertinence comportementale des stimuli lors de l'apprentissage associatif

May 28, 2023

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 11995 (2022) Citer cet article

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Le noyau reuniens (RE) est nécessaire pour les souvenirs dépendant de l'interaction entre le cortex préfrontal médian (mPFC) et l'hippocampe (HPC). Un exemple est le conditionnement du clignement des yeux, dans lequel le mPFC présente une activité différentielle par rapport aux stimuli conditionnés neutres (CS) en fonction de leur contingence avec un stimulus aversif inconditionné (US). Pour tester si ce signal de pertinence est acheminé vers le RE, nous avons enregistré par photométrie les terminaux d'axones mPFC dans le RE et suivi leurs changements avec l'apprentissage. À titre de comparaison, nous avons mesuré l'activité terminale préfrontale dans le thalamus médiodorsal (MD), qui manque de connectivité avec le HPC. Chez les rats mâles naïfs, les terminaisons préfrontales au sein de l'ER n'étaient pas fortement activées par le ton ou la lumière. Au fur et à mesure que les rats associaient l'un des stimuli (CS +) aux États-Unis, les terminaux augmentaient progressivement leur réponse au CS + mais pas à l'autre stimulus (CS-). En revanche, les réponses évoquées par le stimulus des terminaux préfrontaux dans le MD étaient fortes même avant le conditionnement. Ils sont également devenus augmentés uniquement au CS + lors de la première séance de conditionnement ; cependant, le degré de différenciation des activités ne s'améliorait pas avec l'apprentissage. Ces résultats suggèrent que l'apprentissage associatif a augmenté de manière sélective la sortie de mPFC vers le RE, signalant la pertinence comportementale des stimuli sensoriels.

La capacité à former des associations entre des signaux environnementaux et des résultats saillants est un processus cognitif crucial sur lequel les organismes s'appuient pour s'adapter et survivre. Ce processus d'apprentissage associatif est fréquemment étudié à l'aide de paradigmes de conditionnement classiques. En particulier, le conditionnement du clignement des paupières (TEBC) teste la capacité du sujet à associer un stimulus sensoriel neutre (connu sous le nom de stimulus conditionné [CS]) à un choc de paupière légèrement aversif (connu sous le nom de stimulus inconditionné [US]) qui est présenté après un bref intervalle de temps (appelé intervalle de trace). L'inclusion de ce retard temporel nécessite par conséquent l'intégrité des régions du cerveau antérieur, y compris l'hippocampe (HPC)1,2,3 et le cortex préfrontal médial (mPFC)4,5,6,7 en plus des circuits moteurs dans le cervelet et le tronc cérébral8 ,9. De plus, la formation de ces associations de stimulus CS-US s'accompagne du développement de schémas de tir sélectifs pour les associations dans le HPC10,11 dorsal et le mPFC12,13,14,15. De plus, avec l'apprentissage, le mPFC a développé une activité oscillatoire thêta et gamma induite par un stimulus plus forte16,17,18. De plus, l'activité de la bande thêta mPFC devient temporairement couplée à l'activité de la bande thêta HPC19. Collectivement, ces résultats suggèrent qu'une interaction étroite entre le mPFC et le HPC est essentielle pour la formation d'associations de stimulus dans le TEBC.

Il existe plusieurs voies anatomiques qui peuvent soutenir l'interaction mPFC-HPC. Bien que les projections monosynaptiques proviennent du HPC ventral vers le mPFC, le mPFC manque de projections excitatrices monosynaptiques vers le HPC20,21. Au lieu de cela, le mPFC peut influencer l'activité neuronale HPC via plusieurs voies multi-synaptiques impliquant des structures intermédiaires. On pense que le noyau reuniens du thalamus médian (RE) est l'une de ces régions intermédiaires22,23,24, car il possède des connexions anatomiques réciproques avec le mPFC et le HPC25,26,27. Des études antérieures ont montré que le RE joue un rôle déterminant dans le soutien de la synchronicité mPFC-HPC28,29,30 et la performance dans les tâches nécessitant une interaction mPFC-HPC, telles que l'évitement passif31, la navigation spatiale32,33, les tâches spatiales de mémoire de travail28,34, le conditionnement contextuel de la peur35, 36,37,38, et séquencer les tâches de mémoire39. En particulier, la formation d'associations de stimulus dans TEBC a été altérée par une stimulation électrique à haute fréquence du RE au cours des deux premiers jours de conditionnement chez la souris40.

Bien que les preuves susmentionnées soutiennent la nécessité du RE pour faciliter l'interaction mPFC-HPC sous-jacente à diverses formes de processus cognitifs, on ne sait toujours pas quel type d'information est transmis dans la voie mPFC-RE-HPC, et plus précisément, le degré de quelle sortie mPFC est liée aux caractéristiques relationnelles et physiques d'un stimulus. Pour aborder ce point, nous avons effectué des enregistrements photométriques de la dynamique du calcium dans les axones des neurones mPFC se terminant dans le RE tandis que les rats subissaient TEBC. L'utilisation de TEBC permet un contrôle précis du moment et de la contingence des stimuli, ce qui nous permet de différencier les modèles d'activité sélectifs pour les caractéristiques de stimulation sensorielle et relationnelle, ainsi que sa corrélation avec la performance des tâches. À titre de comparaison, nous avons étudié les changements liés à l'apprentissage dans l'activité des axones mPFC se terminant dans le thalamus dorsal médial (MD). Le MD est un contrôle idéal basé sur sa spécificité de projection, car il reçoit de fortes projections monosynaptiques du mPFC41,42,43 mais ne projette pas vers le HPC44,45. Nous avons constaté que les sorties préfrontales vers le RE et le MD étaient sélectives pour les associations de stimulus ; cependant, seul le premier augmentait sa sélectivité avec l'apprentissage.

Un total de 40 rats mâles Long-Evans (Charles River Laboratories), âgés de 77 jours à leur arrivée, ont été logés individuellement dans des cages en plastique transparent dans une salle de colonie domestique et maintenus sur un cycle lumière/obscurité inversée de 12 h (obscurité de 10: 00 à 22h00) avec accès gratuit à la nourriture et à l'eau. Leurs poids trois semaines après leur arrivée variaient de 375 à 410 g. La justification de l'utilisation de rats mâles uniquement était : (1) les différences entre les sexes dans les capacités d'apprentissage du conditionnement du clignement des yeux dues aux hormones ovariennes46, et (2) des études antérieures examinant la fonction et l'activité du mPFC dans le TEBC ont été menées exclusivement sur des rats mâles7,12,16, 17. Des expériences comportementales ont été réalisées pendant le cycle d'obscurité. Au total, 22 rats ont été utilisés dans l'expérience 1 (inactivation pharmacologique du RE) et 18 rats ont été utilisés dans l'expérience 2 (photométrie). Dans l'expérience 1, cinq rats ont été retirés en raison d'une canule mal ciblée, laissant 17 rats pour l'analyse des données comportementales. Dans l'expérience 2, quatre rats ont été retirés en raison de fibres optiques mal ciblées, et un rat a été retiré en raison de la rupture du noyau interne de la fibre pendant le conditionnement comportemental, ce qui a laissé un total de 13 rats pour l'analyse des données comportementales et photométriques. Toutes les procédures ont été effectuées conformément au National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals (Publication NO. 85–23, révisée en 1985), au Conseil canadien de protection des animaux, à la norme éthique APA, aux lignes directrices ARRIVE et approuvées par le comité de protection des animaux de l'Université de Toronto (AUP20011400).

Les rats utilisés dans l'expérience 1 ont subi une procédure chirurgicale impliquant l'implantation d'une canule de perfusion et de fils oculaires. Les rats utilisés dans l'expérience 2 ont subi deux procédures chirurgicales, d'abord une chirurgie d'infusion de vecteur viral, suivie d'une chirurgie d'implantation de fibre optique et de fil oculaire.

Trois semaines après leur arrivée à l'établissement, les rats de l'expérience 2 ont été anesthésiés (2,0 à 2,5 % d'isoflurane en volume dans de l'oxygène à un débit de 0,8 L/min ; Halocarbon Laboratories) et placés dans un cadre stéréotaxique. La peau et les tissus au-dessus du crâne ont été rétractés et un trou a été percé dans les deux hémisphères au-dessus du mPFC. Une aiguille de perfusion en acier inoxydable 30G connectée à une micro-seringue (Hamilton) via un tube en polyéthylène a été utilisée pour délivrer AAV9.CAG.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene) à ces coordonnées : antéropostérieur (AP) = + 2,7, médiolatéral (ML) = ± 0,55, dorso-ventral (DV) = − 3,9 mm du bregma. Le vecteur viral (0,75 µl/hémisphère) a été injecté à un débit de 0,1 µl/min. L'aiguille a été laissée en place pendant cinq minutes après la fin de l'injection, puis elle a été rétractée à DV = - 3,7 mm et laissée là pendant cinq minutes supplémentaires pour assurer une diffusion réussie du vecteur. L'aiguille a ensuite été lentement rétractée et l'incision a été suturée. Les rats ont été traités avec un analgésique (carprofène, 5 mg/kg, sous-cutané) pendant 48 h après la chirurgie. Les rats ont été logés dans leur cage à domicile pendant deux mois après la chirurgie pour permettre l'incubation et l'expression virales.

Pour l'expérience 1, cinq semaines après leur arrivée à l'établissement, les rats ont été anesthésiés à l'isoflurane et placés dans un cadre stéréotaxique. La peau et les tissus au-dessus du crâne ont été rétractés et un trou a été percé au-dessus du RE dans l'hémisphère droit (AP = - 2,1, ML = + 2,0 mm du bregma). Une canule de guidage (Plastics One) a été abaissée à travers le trou ciblant le RE et coiffée d'un stylet factice (AP = − 2,1, ML = + 2,0, DV = − 6,5 mm du bregma à un angle de 15º sur la ligne médiane). La canule a été fixée au crâne à l'aide de vis en acier inoxydable et d'acrylique dentaire. La canule de perfusion utilisée pour administrer les médicaments s'étendait sur 1 mm au-delà de la pointe de la canule guide. Quatre fils en acier inoxydable revêtus de téflon attachés à un capuchon de connecteur (Plastics One) ont été implantés par voie sous-cutanée dans l'orbicularis oculi supérieur gauche (muscle de la paupière) pour enregistrer l'activité de l'électromyogramme (EMG) et délivrer un choc périorbitaire. Une vis de masse en acier inoxydable a été installée sur l'os pariétal droit et reliée au capuchon du connecteur. Le capuchon du connecteur et la vis de terre ont été fixés au crâne avec des vis en acier inoxydable et de l'acrylique dentaire. Les rats ont été traités avec un analgésique (carprofène, 5 mg/kg, sous-cutané) pendant 48 h après la chirurgie et laissés dans leur cage d'origine pendant une semaine pour récupérer.

Pour l'expérience 2, après incubation virale, les rats ont été anesthésiés à l'isoflurane et placés dans un cadre stéréotaxique. La peau au-dessus du crâne a été rétractée et des trous ont été percés bilatéralement au-dessus du RE (AP = - 2,1, ML = ± 2,0 mm du bregma) ou du MD (AP = - 2,6, ML = ± 2,1 mm du bregma). Des fibres optiques (NA 0,48, taille de cœur 400 µm, FP400URT, Thorlabs) collées sur des ferrules en acier inoxydable (Ø2,5 mm, Thorlabs) ont été implantées ciblant soit le RE (AP = − 2,1, ML = ± 2,0, DV = − 7,3 mm du bregma à un angle de 15º) ou MD (AP = − 2,6, ML = ± 2,1, DV = − 6,35 mm du bregma à un angle de 15º). Les fibres optiques ont été fixées au crâne à l'aide de vis en acier inoxydable et d'acrylique dentaire. Les fibres optiques ont ensuite été recouvertes d'un capuchon protecteur anti-poussière (Thorlabs). Le capuchon du connecteur avec ses quatre fils oculaires et une vis de mise à la terre a ensuite été installé selon le même protocole que l'expérience 1. Les soins chirurgicaux post-implantation ont été identiques à l'expérience 1.

Dans l'expérience 1, le paradigme comportemental a duré 12 jours au total. Les deux premiers jours consistaient à habituer les rats à la chambre de conditionnement et aux procédures, tandis que les 10 jours suivants impliquaient une formation dans la première version d'un paradigme différentiel de conditionnement des traces de clignement des yeux (DTEBC1). Pendant les jours d'habituation (H1 à H2), les rats ont été placés dans un récipient cylindrique en plastique (21 cm de diamètre) logé à l'intérieur d'une chambre d'atténuation du son et de la lumière, en l'absence de tout stimulus, pendant 50 min. À partir du troisième jour, les rats ont subi un DTEBC1 dans lequel ils ont été présentés avec deux types d'essais différents. Dans le premier type d'essai, un stimulus conditionné par tonalité (TCS+, 100 ms, 2,5 kHz, 85 dB) a été associé à un léger choc des paupières (stimulus non conditionné [US], 100 ms, 100 Hz) séparés par un stimulus de 500 ms -intervalle libre. Dans le deuxième type d'essai, un stimulus lumineux conditionné (LCS-, 100 ms, 50 Hz) a été présenté seul. Bien que nous n'ayons pas contrebalancé les stimuli dans l'expérience 1, nous avons confirmé avec l'expérience 2 que les rats associent le ton et la lumière aux États-Unis de manière comparable, quel que soit celui des deux stimuli qui était associé aux États-Unis. Les séances de conditionnement quotidiennes consistaient en un total de 100 essais, chaque essai ayant 50 % de chances d'être soit un essai TCS+ soit un essai LCS-. La présentation du type d'essai a été randomisée, de sorte que le rat ne savait pas quel essai serait présenté ensuite. Les intervalles inter-essais étaient pseudo-randomisés entre 20 et 40 s avec une moyenne de 30 s. Chaque séance de conditionnement a duré environ 50 min.

La synchronisation et la livraison du stimulus ont été contrôlées par un micro-ordinateur (Arduino Mega, Arduino). Le stimulus sonore était présenté via un haut-parleur monté au plafond à l'intérieur de la chambre, le stimulus lumineux était présenté via une LED installée au niveau des yeux sur le côté de la chambre, et les États-Unis, qui étaient délivrés à la paupière via des fils oculaires implantés, étaient piloté par un isolateur de stimulus (ISO-Flex, AMPI). Le niveau de choc américain a été initialement fixé à 0,3 mA et a été ajusté individuellement pour chaque rat pour induire la réponse inconditionnée (un clignement d'œil/tour de tête), qui a été surveillée par des caméras infrarouges montées à l'intérieur des chambres.

La réponse conditionnée (CR) a été définie comme des réponses de clignement d'œil déclenchées pendant une fenêtre de 200 ms immédiatement avant l'apparition des États-Unis. Cette même fenêtre temporelle a été utilisée dans les essais où les États-Unis étaient absents. Les paramètres ci-dessus ont été choisis sur la base de nos travaux précédents, qui ont montré que sur 10 sessions, les rats augmentaient régulièrement la proportion d'essais dans lesquels ils exprimaient un CR18,19. Les réponses au clignement des yeux ont été surveillées en enregistrant l'activité EMG du muscle orbiculaire supérieur gauche à travers deux fils en acier inoxydable implantés chirurgicalement. L'activité EMG a été filtrée passe-bande entre 0,3 et 3,0 kHz, numérisée à 6 102 Hz et stockée à l'aide d'un système d'enregistrement RZ-5 (Tucker-Davis Technologies).

Dans l'expérience 2, le paradigme comportemental a duré 13 jours au total. Les deux premiers jours consistaient à habituer les rats à la chambre de conditionnement et aux procédures, le troisième jour impliquait des tests de réponse de stimulus naïfs et les 10 jours suivants impliquaient une formation dans la version deux d'un paradigme différentiel de conditionnement des traces de clignement des yeux (DTEBC2). Les jours d'accoutumance un et deux étaient identiques à ceux de l'expérience 1, sauf que la durée de chaque session était de 75 minutes. Le troisième jour (Session 0), les rats ont été placés à l'intérieur de leurs chambres de conditionnement pour des tests naïfs de réponse au stimulus. Les rats ont été présentés avec trois types d'essais, le premier type impliquait la présentation d'un stimulus de tonalité neutre (TS) par lui-même, le type deux impliquait la présentation d'un stimulus lumineux neutre (LS) par lui-même et le type trois impliquait la présentation des États-Unis par lui-même. La session 0 consistait en 150 essais au total, avec 50 essais attribués à chaque type. À partir du quatrième jour (sessions 1 à 10), les rats ont subi un DTEBC2, dans lequel ils ont été entraînés dans un conditionnement renforcé par le ton (cinq rats RE et cinq rats MD) ou renforcé par la lumière (un rat RE et deux rats MD). Des rats de conditionnement renforcés de ton ont été présentés avec trois types d'essais différents. Dans le premier type d'essai, un stimulus de tonalité neutre était associé aux États-Unis, séparés par un intervalle sans stimulus de 500 ms (stimulus conditionné plus et États-Unis [CS+US]). Dans le deuxième type d'essai, le même stimulus sonore a été présenté seul (stimulus conditionné plus [CS+]). Dans le troisième type d'essai, un stimulus lumineux neutre était présenté seul (stimulus conditionné moins [CS-]). Les rats entraînés à un conditionnement léger renforcé ont également eu trois types d'essais ; cependant, les identités des stimuli ont été permutées, de sorte que les essais CS+US associaient désormais la lumière au choc, les essais CS+ étaient la lumière présentée seule et les essais CS- étaient le ton présenté seul. Les séances de conditionnement quotidiennes consistaient en un total de 150 essais, les essais CS+US ont eu lieu avec une probabilité de 68 % tandis que les essais CS+ et CS- ont eu lieu chacun avec une probabilité de 16 %. Pour la session 0 et les sessions 1 à 10, chaque session a duré environ 75 minutes, les intervalles entre les essais et la randomisation du type d'essai étaient similaires à l'expérience 1.

L'inclusion d'essais de CS seuls nous a permis d'examiner le changement de signal photométrique évoqué uniquement par le CS en l'absence de toute contamination par le changement de signal évoqué par les États-Unis. Cela nous a permis de mieux mesurer le changement dans l'activité évoquée du CS lorsque les rats formaient des associations de stimulus différentielles.

Toutes les analyses ont été effectuées à l'aide d'un code personnalisé écrit dans MATLAB (version 2021a, Mathworks)18,19. Pour chaque session par rat, l'amplitude du signal EMG pendant chaque tranche de temps de 1 ms a été calculée en soustrayant le signal minimum du signal maximum pendant cette tranche. L'amplitude EMG a été moyennée pendant une fenêtre de 300 ms avant le début du CS dans chaque essai. La ligne de base a été définie comme la médiane de l'amplitude EMG moyenne plus un écart type. L'activité EMG au-dessus du seuil a été moyennée ensemble pendant la période de 300 ms avant le début du CS (pré-valeur) et pendant une fenêtre de 200 ms avant le début de l'US (valeur CR). La valeur CR a été conçue pour capturer les réponses de clignotement adaptatif qui se produisent immédiatement avant le début de l'US. Un essai était défini comme un essai CR si la valeur CR était au moins cinq fois supérieure à celle de la pré-valeur. Les essais dans lesquels la pré-valeur dépassait 30 % du seuil ont été classés comme essais "hyperactifs" et rejetés. Le pourcentage de réponses conditionnées (RC%) dans chaque type d'essai était le nombre d'essais de RC pour ce type d'essai, divisé par le nombre total d'essais valides pour ce type. Le pourcentage d'essais hyperactifs a été calculé en divisant le nombre total d'essais classés comme hyperactifs par le nombre total d'essais (Expérience 1 : # hyperactif/100, Expérience 2 : # hyperactif/150). Pour représenter visuellement le schéma temporel de l'activité EMG à des jours spécifiques, l'amplitude EMG a d'abord été normalisée par division avec la pré-valeur dans chaque essai. L'amplitude EMG normalisée pour cet essai a ensuite été moyennée sur tous les essais valides du même type d'essai chez chaque rat, puis sur les rats pendant des jours spécifiques. Pour l'expérience 1, nous avons examiné le schéma temporel de l'activité EMG en calculant la latence jusqu'à l'apparition de la CR, ainsi que la latence jusqu'au pic de la CR chez chaque rat au cours de la dernière session. Seuls les essais dans lesquels le rat présentait une RC ont été utilisés pour l'analyse de la latence. La première amplitude EMG dans une fenêtre de 1,3 s à partir de 300 ms avant le début du CS a été extraite de chaque essai. Les valeurs EMG ont ensuite été soustraites par la pré-valeur (EMG-Pre) et les 300 premières ms de données ont été moyennées et multipliées par cinq pour générer la valeur seuil CR. La latence jusqu'au début du CR a ensuite été définie comme le premier point dans le temps dans une fenêtre de 500 ms après la fin du CS où la valeur EMG-Pre dépassait la valeur seuil du CR. La latence jusqu'au pic du CR a été définie comme le point temporel au cours de la même fenêtre de 500 ms où la valeur EMG-Pre était la plus élevée. Enfin, les latences d'apparition et de pointe dans chaque essai ont été moyennées pour tous les essais du même type chez chaque rat.

Les rats ont reçu des perfusions intracrâniennes de leurs solutions assignées à partir du deuxième jour d'accoutumance et pendant les 10 jours de DTEBC1. Les rats retenus dans un cône en plastique souple ont été infusés 20 min avant le début du conditionnement. La perfusion consistait soit en une solution de bromhydrate de muscimol (0,5 mg dans 0,5 ml de liquide céphalo-rachidien artificiel [aCSF], G019 Sigma-Aldrich), soit en aCSF. Un total de 500 nl a été perfusé en une minute. Ensuite, la canule de perfusion a été laissée en place pendant une minute supplémentaire avant l'extraction. La concentration de médicament, les volumes de perfusion et le débit de perfusion ont été choisis sur la base de nos études précédentes, qui ont révélé que la propagation du muscimol était confinée à une plage maximale de 1 mm à partir de la pointe de la canule47,48. Le groupe muscimol totalisait huit rats tandis que le groupe témoin aCSF en totalisait neuf.

Des enregistrements photométriques des terminaux préfrontaux dans le RE et le MD ont été effectués en mesurant la fluorescence en vrac via une seule fibre optique à travers laquelle la lumière excitatrice a été délivrée et la fluorescence émise a été capturée. Une LED de 465 nm modulée à 381 Hz a été utilisée pour stimuler GCaMP6f., émettant une fluorescence dépendante du calcium. Une LED de 405 nm modulée à 221 Hz a été utilisée pour stimuler GCaMP6f. à sa longueur d'onde isosbétique d'excitation, émettant une fluorescence indépendante du calcium. La modulation a été réalisée via un système d'enregistrement RZ5 (Tucker Davis Technologies). La lumière des deux LED a été couplée dans un mini-cube de fluorescence intégré (IFMC, Doric Lenses) qui émettait les deux flux de lumière dans un cordon de raccordement à fibre couplé (NA 0,48, taille du noyau 400 µm, Doric Lenses). Le cordon de raccordement a ensuite été accouplé avec l'ensemble de fibre optique et de férule implanté à l'aide d'un manchon en zircone opaque (Thorlabs). La puissance de sortie des deux LED mesurée à l'extrémité du cordon de raccordement était de 60 µW (PM100D, Thorlabs). La fluorescence émise par l'animal est passée à travers le cordon de raccordement et dans l'IFMC qui a été couplé à un photorécepteur femtowatt (lentilles doriques). La sortie du photorécepteur a ensuite été introduite dans le système d'enregistrement RZ5 qui a démodulé et échantillonné la sortie à 1 kHz. Les enregistrements photométriques ont eu lieu du deuxième au treizième jour de l'expérience 2. Étant donné que chaque session a duré 75 minutes, nous n'avons allumé les LED que pendant une courte durée verrouillée sur les stimuli afin de minimiser le photoblanchiment au cours de chaque session. Le deuxième jour (Hab 2), les LED ont été allumées pendant neuf secondes toutes les 30 s. Le troisième jour (Session 0), les LED ont été allumées quatre secondes avant le début du TS, LS et US, et laissées allumées pendant neuf secondes à chaque essai. Les jours 4 à 13 (sessions 1 à 10), les LED ont été allumées quatre secondes avant le début du CS et laissées allumées pendant un total de neuf secondes à chaque essai. Chez les deux premiers rats conditionnés, une petite quantité d'artefact a été détectée lors de la livraison aux États-Unis au cours de la session 0, cet artefact n'a pas été vu pour le TS ni le LS. Conformément aux analyses ultérieures des réponses terminales envers le CS, nous avons choisi de n'analyser que l'activité évoquée par le TS et le LS dans la session 0.

À l'aide d'un code MATLAB personnalisé, l'activité de fluorescence d'une stimulation à 405 nm a été utilisée pour corriger l'artefact de mouvement et le photoblanchiment. Tout d'abord, parce que la sortie fluorescente s'est stabilisée dans les deux secondes suivant le début de la LED, les signaux à 465 nm et 405 nm des sept dernières secondes de la LED de neuf secondes ont été extraits de chaque essai. Le signal de 405 nm a ensuite été ajusté au signal de 465 nm en utilisant une approche d'ajustement linéaire des moindres carrés, le ΔF/F a ensuite été calculé comme suit : (signal de 465 nm - signal de 405 nm ajusté)/signal de 405 nm ajusté. Les valeurs ΔF/F résultantes représentaient l'activité calcique deux secondes avant et cinq secondes après le début du CS dans chaque essai. Les valeurs ΔF/F ont ensuite été moyennées sur tous les essais partageant le même type d'essai pour cette session.

Pour représenter l'activité calcique évoquée par le CS dans les terminaux préfrontaux au sein du RE ou du MD, les valeurs ΔF/F dans une fenêtre de six secondes à partir de deux secondes avant le début du CS ont été regroupées pour la première fois en fonction du type d'essai, les valeurs ont ensuite été moyennées entre les essais de chaque session. Pour la comparaison des réponses ΔF/F à différents types de CS, les valeurs d'aire sous la courbe (AUC) ont été calculées en additionnant les valeurs ΔF/F moyennes de l'essai dans une fenêtre de deux secondes pour chaque session chez chaque rat. Pour la ligne de base AUC, la fenêtre a commencé deux secondes avant le début du CS, tandis que pour la réponse CS AUC, la fenêtre a commencé à partir de la fin du CS. Les valeurs de l'ASC ont ensuite été moyennées sur les rats de chaque session.

Une fois les tests comportementaux terminés, les rats ont été profondément anesthésiés avec une quantité excessive de pentobarbital sodique (80 mg/kg, Bimeda). Ils ont d'abord été perfusés par voie transcardiaque avec une solution saline physiologique à 0,9 % réfrigérée, suivie de paraformaldéhyde à 4 % réfrigéré (PFA). Les cerveaux ont été extraits et laissés immergés dans du PFA à 4 % à 4 ° C pendant deux heures, suivis d'une immersion dans une solution saline tamponnée au phosphate - solution de saccharose à 30 % (PBS-Suc) pendant 48 h. Des tranches de cerveau coronales (45 μm) sur toute l'étendue antéro-postérieure du mPFC, RE et MD ont été collectées à l'aide d'un cryostat (CM3050S, Leica Biosystems). Les coupes de tissus ont été stockées dans des tubes remplis de tampon de stockage de tissus (PBS-Suc et solution d'éthylène glycol), tous les tubes ont ensuite été stockés à - 20 ° C. Pour localiser les emplacements des canules de perfusion, le tissu a été monté sur une lame de verre et coloré avec du violet de crésyle. Une fine couche de solution de montage Cytoseal 280 (#8311–4, Thermo Fisher Scientific) a été appliquée avec une lamelle de verre. Les lames ont été visualisées au microscope optique (Leica DM400b). Pour localiser les placements de fibres optiques, le tissu a été monté sur une lame de verre, puis scellé à l'aide de Cytoseal et d'une lamelle de verre. Les lames ont été visualisées sous un microscope à fluorescence droit (Zeiss AxioImager 2.0). Les emplacements des canules et des fibres optiques ont ensuite été dessinés sur des plaques de l'atlas stéréotaxique du cerveau de rat49. Seuls les rats avec une canule ciblant avec précision le RE ont été utilisés dans l'expérience 1, et seuls les rats avec une fibre optique ciblant avec précision le RE ou le MD ont été utilisés dans l'expérience 2.

La taille de l'échantillon pour l'expérience 1 (inactivation pharmacologique du RE) était basée sur nos précédentes études comportementales utilisant TEBC7,16,17. De même, la taille de l'échantillon pour l'expérience 2 (photométrie) était basée sur la taille de l'échantillon utilisée pour rapporter les données de potentiel de champ local dans nos articles précédents16,17,18. Les données ont été présentées sous forme de moyenne du groupe ± erreur standard de la moyenne (SEM). Les analyses statistiques ont été réalisées avec les logiciels statistiques MATLAB et SPSS (IBM). Pour déterminer la signification statistique, nous avons utilisé : une analyse de variance à mesures répétées (ANOVA), une ANOVA à mesures mixtes/répétées à deux facteurs, une ANOVA mixte à trois facteurs, un test t à un échantillon, des tests t appariés et non appariés, des tests linéaires analyse de régression et corrélation de Pearson. La signification a été définie comme *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Tout d'abord, nous avons cherché à confirmer que le RE était nécessaire à la formation d'associations de stimulus dans le DTEBC en examinant l'impact de l'inactivation pharmacologique du RE sur l'acquisition du CR. Après deux jours de sessions d'accoutumance, 22 rats ont subi 10 sessions d'acquisition, au cours desquelles le stimulus sonore était apparié avec l'US (TCS+), tandis que le stimulus lumineux (LCS-) était présenté seul (Fig. 1a). Avant chaque session d'acquisition, le muscimol, agoniste des récepteurs GABAA, a été perfusé (Fig. 1b) dans le RE de 11 rats (groupe muscimol), tandis que les 11 autres ont reçu des perfusions de liquide céphalo-rachidien artificiel (groupe témoin). Cinq rats ont été retirés en raison d'une canule mal ciblée, laissant huit rats dans le groupe muscimol et neuf rats dans le groupe témoin (Fig. 1c). Au cours de 10 séances de conditionnement, le groupe témoin a progressivement augmenté la proportion d'essais TCS + dans lesquels il a exprimé des RC (Fig. 1d). Comparé aux témoins, le groupe muscimol a exprimé des RC dans un nombre inférieur d'essais TCS + (Fig. 1d, ANOVA mixte à trois facteurs, interaction Session × Groupe × Type CS, F (9 135) = 2, 299, p = 0, 020. Suivi deux- ANOVA mixte pour les essais TCS+, Session, F(9 135) = 21,037, p < 0,001 ; Groupe, F(1,15) = 8,266, p = 0,012 ; Interaction Session × Groupe, F(9 135) = 3,264, p = 0,001 ). Plus précisément, le groupe muscimol a exprimé un nombre significativement plus faible de CR lors de la session sept (tests t non appariés corrigés pour les comparaisons multiples, t15 = 4,026, p = 0,001), alors qu'il y avait une tendance à une expression de CR plus faible lors des sessions cinq à six et huit à 10 (p = 0,005–0,054). En parallèle, les deux groupes ont montré une légère augmentation du nombre de RC exprimées dans les essais LCS ; cependant, la fréquence d'expression de la CR était plus élevée dans le groupe muscimol que dans le groupe témoin (analyse de variance mixte à deux facteurs de suivi pour les essais LCS, session, F(9,135) = 2,362, p = 0,016 ; groupe, F(1,15) = 5,063, p = 0,040 ; interaction Session × Groupe, F(9 135) = 0,930, p = 0,502). De plus, au cours des trois derniers jours, les deux groupes ont montré un % de RC plus élevé dans les essais TCS+ par rapport aux essais LCS- (ANOVA mixte à deux facteurs sur le % de RC moyen au cours des trois derniers jours, interaction groupe × type CS, F(1,15 ) = 8,732, p = 0,010 ; type SC, F(1,15) = 85,170, p < 0,001 ; groupe, F(1,15) = 4,845, p = 0,044). Les tests t non appariés de suivi corrigés pour les comparaisons multiples ont révélé que le groupe muscimol avait un % de RC significativement plus faible dans les essais TCS+ par rapport aux témoins (t15 = 2,665, p = 0,018), tandis que le % de RC dans les essais LCS était comparable entre les groupes (t15 = − 1,421, p = 0,176). De plus, le groupe muscimol ne différait pas du groupe témoin en termes de nombre d'essais au cours desquels ils ont montré des sauts, des cabrages ou des toilettages immédiatement avant le début du CS (Fig. 1e, ANOVA mixte à deux voies, interaction Session × Groupe, F (9 135) = 1,144, p = 0,336 ; Session, F(9 135) = 1,765, p = 0,081 ; Groupe, F(1,15) = 0,539, p = 0,474), ce qui indique que l'inhibition de l'ER n'a pas eu d'impact sur les niveaux d'activité de base. Ces résultats suggèrent que l'inhibition de l'ER a altéré la capacité des rats à former des associations de stimulus ; cependant, leur capacité à distinguer le ton des stimuli lumineux n'a pas été affectée.

L'inactivation réversible de l'ER altère l'apprentissage associatif différentiel mais pas la discrimination des stimuli. (a) Paradigme comportemental. Les deux types d'essais ont été aléatoirement mélangés et présentés sur des sessions d'une durée de 50 min. ( b ) Les réponses conditionnées (CR) ont été détectées en enregistrant l'activité de l'électromyogramme (EMG) du muscle orbicularis oculi (paupière) gauche. Une canule de microperfusion a été implantée ciblant le RE. ( c ) Trois à gauche: reconstruction histologique des emplacements de la pointe de la canule dans le RE pour tous les rats inclus dans les analyses finales. Les barres noires et rouges indiquent la position de la canule de perfusion pour les groupes contrôle (N = 9) et muscimol (N = 8), respectivement. La numérotation en haut indique les coordonnées antéro-postérieures (AP) du bregma. À droite : section représentative dans le RE. ( d ) Proportion d'essais dans lesquels les rats ont exprimé le CR au TCS + et au LCS- (* p <0, 05, interaction groupe × type CS). Les barres d'erreur indiquent ± erreur standard de la moyenne (SEM). (e) Pourcentage d'essais hyperactifs (moyenne ± SEM). ( f ) Amplitude EMG normalisée moyenne lors de la session 10. Les rectangles bleus et verts indiquent respectivement la présentation TCS + et LCS-. Un rectangle noir indique la présentation américaine. Les zones ombrées indiquent ± SEM.

Pour examiner si l'inhibition de l'ER a eu un impact sur le schéma temporel de la réponse conditionnée au clignement des yeux, nous avons représenté le CR intégré moyen pour les deux groupes et les types de CS lors de la dernière session (Fig. 1f). Par rapport au groupe témoin, l'amplitude moyenne de l'EMG dans les essais TCS + était plus faible dans le groupe muscimol, confirmant davantage le nombre réduit de CR exprimés (Fig. 1f en haut). Cependant, les schémas temporels de l'amplitude EMG moyenne étaient comparables entre les deux groupes. Aucune différence n'a été trouvée entre les groupes pour leur latence à l'apparition de la RC (groupe contrôle : 238 ± 36 ms ; groupe muscimol : 226 ± 41 ms ; test t non apparié, t15 = 0,225, p = 0,825), ni la latence à la pic (groupe contrôle : 448 ± 10 ms ; groupe muscimol : 411 ± 17 ms ; t15 = 1,917, p = 0,074). De même, dans les essais LCS, aucune différence n'a été trouvée entre les groupes pour leur latence d'apparition (groupe témoin : 192 ± 39 ms ; groupe muscimol : 241 ± 57 ms ; t15 = − 0,723, p = 0,481), ni latence au pic (groupe contrôle : 434 ± 17 ms ; groupe muscimol : 416 ± 23 ms ; t15 = 0,674, p = 0,510). Par conséquent, bien que l'inhibition de RE ait réduit le nombre de CR exprimés, elle n'a pas affecté le schéma temporel global des CR.

Après avoir établi que l'intégrité du RE est nécessaire à la formation d'une association de stimulus, nous avons ensuite étudié comment les terminaux préfrontaux au sein du RE et du MD ont répondu aux stimuli lorsque les rats les ont associés au choc de la paupière. À cette fin, nous avons infusé bilatéralement un vecteur viral dans le mPFC pour exprimer l'indicateur de calcium génétiquement codé (GCaMP6f.) Dans les neurones mPFC (Fig. 2a). L'activité de leurs terminaux au sein du RE ou du MD a été surveillée par une fibre optique implantée de manière chronique dans le RE ou le MD (neuf rats pour chaque région). Expression de GCaMP6f. était localisée dans la région prélimbique (PrL) du mPFC dans les deux hémisphères, avec une expression minimale dans les cortex cingulaire antérieur (ACC) et infralimbique voisins (IL, Fig. 2b). Sur les 18 rats, quatre rats ont été retirés en raison de fibres optiques mal ciblées et un rat a été retiré en raison de la rupture du noyau interne de la fibre pendant le conditionnement comportemental. Cela a laissé un total de six rats avec des fibres optiques ciblant les terminaux au sein du RE (groupe RE) et sept rats avec des fibres ciblant le MD (groupe MD, Fig. 2c). Toutes les analyses ultérieures de l'expérience 2 ont donc été effectuées uniquement sur ces rats. Nous avons confirmé que le signal dépendant du calcium à 465 nm était nettement différent du signal indépendant du calcium à 405 nm (Fig. 2d). Les valeurs ΔF/F calculées à partir de ces deux signaux nous ont permis d'examiner les transitoires de calcium moins toute contamination due au photo-blanchiment ou aux artefacts de mouvement (voir Méthodes).

Les terminaux préfrontaux au sein de l'ER ne sont pas activés par des signaux sensoriels dépourvus de qualités mnémoniques. ( a ) Terminaux préfrontaux (région prélimbique [PrL]) exprimant GCaMP6f. ont été enregistrés dans le RE ou le MD. ( b ) Reconstruction histologique et section représentative du mPFC montrant GCaMP6f. expression (vert). Les perfusions virales étaient bilatérales ; les hémisphères ont été superposés pour afficher la propagation dans les deux hémisphères. La numérotation indique la coordonnée AP de bregma. Abréviations : cortex cingulaire antérieur (ACC), cortex infralimbique (IL). (c) En haut : reconstruction histologique du placement de la pointe de la fibre optique dans le RE et le MD. En bas : sections représentatives dans la zone agrandie. La numérotation indique la coordonnée AP de bregma. ( d ) Signaux dépendants du calcium représentatifs (465 nm) et indépendants (405 nm) provenant de l'enregistrement photométrique des terminaux préfrontaux dans le MD chez un rat représentatif lors de la présentation du ton. Deux lignes verticales indiquent le début et la fin de la tonalité. Les lignes pointillées indiquent ± SEM (N = 25 présentations). ( e ) Réponses terminales préfrontales aux stimuli de la session 0 en moyenne sur les rats. Les zones ombrées indiquent ± SEM (RE, N = 6 rats ; MD, N = 7 rats). (f) Session 0 de base et CS évoqués AUC calculés par sommation des valeurs ΔF/F dans une fenêtre de deux secondes immédiatement avant et après les présentations de CS, respectivement (*p < 0,05, par rapport à la ligne de base). Les barres d'erreur indiquent ± SEM (RE, N = 6 rats; MD, N = 7 rats).

Nous avons d'abord étudié les réponses terminales à deux stimuli sensoriels neutres avant le conditionnement. Après deux jours de sessions d'accoutumance, les rats ont subi une session de test de stimulus de pré-conditionnement (Session 0), cela impliquait des essais dans lesquels un stimulus de tonalité (TS) ou de lumière (LS) était présenté seul. Au cours de la session 0, les présentations du TS et du LS ont évoqué des réponses fortes et clairement définies des terminaux préfrontaux au sein du MD, tandis que les réponses terminales du RE étaient faibles et plus difficiles à distinguer de l'activité de base (Fig. 2e). Pour quantifier si ces réponses étaient significativement supérieures à l'activité de base, nous avons calculé l'aire sous la courbe (AUC) pour nos valeurs ΔF/F pendant une fenêtre de deux secondes avant et après le début du CS. Nous avons constaté que, par rapport à l'activité de base, les terminaux au sein du RE n'étaient pas activés de manière significative par les présentations du TS ou du LS (Fig. 2f à gauche, mesures répétées bidirectionnelles [RM] ANOVA, période de temps × interaction de type CS, F( 1,5) = 0,391, p = 0,559 ; Période, F(1,5) = 1,700, p = 0,249 ; Type CS, F(1,5) = 0,112, p = 0,751). À l'inverse, les terminaux du MD ont été fortement activés par les deux stimuli (Fig. 2f à droite, ANOVA RM bidirectionnelle, période de temps × interaction de type CS, F(1,6) = 1,112, p = 0,332 ; Période de temps, F(1 ,6) = 10,061, p = 0,019 ; type CS, F(1,6) = 0,125, p = 0,736). Ces résultats suggèrent que de nouveaux stimuli sensoriels dépourvus de toute qualité mnémonique activent fortement les terminaux préfrontaux dans le MD mais pas le RE.

Après la session 0, les rats ont été conditionnés pendant 10 jours dans DTEBC2 (Fig. 3a). Le ton a été utilisé comme CS+ pour 10 rats, dont cinq avaient une fibre optique ciblant le RE et les cinq autres le MD. La lumière a été utilisée comme CS + chez les un et deux rats restants avec une fibre optique dans le RE et le MD, respectivement. Au cours de 10 séances de conditionnement, les 13 rats ont progressivement augmenté la proportion d'essais CS + US et CS + dans lesquels ils ont exprimé des CR. Alors que le nombre de RC dans les essais CS est resté faible (Fig. 3b, ANOVA RM bidirectionnelle, interaction Session × Type CS, F(18,216) = 18,418, p < 0,001 ; Session, F(9,108) = 36,220, p < 0,001 ; Type CS, F(2, 24) = 72,052, p < 0,001). Au cours des trois derniers jours, le pourcentage de RC était significativement plus élevé dans les essais CS+US et CS+ par rapport aux essais CS- (ANOVA RM unidirectionnelle sur le pourcentage moyen de RC au cours des trois derniers jours, type CS, F(2,24) = 185,663, p < 0,001. Test t apparié corrigé pour les comparaisons multiples CS- vs., CS+US : t12 = 16,541, p < 0,001 ; CS+ : t12 = 13,524, p < 0,001). Il n'y avait aucune différence de RC % entre les essais CS+US et CS+ (test t apparié corrigé pour les comparaisons multiples, t12 = 0,385, p = 0,707). L'inspection du CR intégré moyen pour le dernier jour de conditionnement a révélé des schémas temporels de réponse au clignement des yeux similaires à ceux de l'expérience 1 (Fig. 3c).

Comportement lors de l'enregistrement photométrique. (a) Paradigme comportemental. Les trois types d'essais ont été aléatoirement mélangés et présentés sur des sessions d'une durée de 75 min. ( b ) Proportion d'essais dans lesquels les rats (N = 13) ont exprimé le CR dans chacun des trois types d'essais (* p <0, 05, interaction Session × Type CS). Les barres d'erreur indiquent ± SEM. ( c ) Amplitude EMG normalisée moyenne lors de la session 10. Le rectangle gris indique la présentation CS. La région de haute amplitude de la trace rose (CS + US) représente l'artefact causé par la livraison des États-Unis. Les zones ombrées indiquent ± SEM.

Au cours des séances de conditionnement quotidiennes, nous avons enregistré l'activité calcique des terminaux préfrontaux dans le RE (Fig. 4a) de six rats. Nous avons constaté que les terminaux du RE répondaient au CS + et au CS- avec une ampleur similaire au cours des premières sessions (Fig. 4b, c). Au fur et à mesure que le conditionnement progressait, le CS+ évoquait progressivement des réponses plus fortes ; alors que les réponses au CS- se sont affaiblies puis sont restées faibles tout au long de l'étude. Pour mieux quantifier le changement de réponse au fil des jours, nous avons calculé l'AUC en additionnant les valeurs ΔF/F pendant une fenêtre de deux secondes juste après la fin du CS. Nous avons constaté que la réponse évoquée CS + était significativement supérieure à la réponse évoquée CS- (Fig. 4d, ANOVA RM bidirectionnelle, interaction Session × Type CS, F (9,45) = 2, 839, p = 0, 010; Session, F (9, 45) = 0,695, p = 0,709 ; type CS, F(1,5) = 47,743, p = 0,001). Des analyses de régression linéaire de suivi ont révélé que les réponses évoquées CS + ont augmenté en amplitude au fil des jours de conditionnement chez cinq rats RE sur six (cinq rats p <0, 05, un rat p = 0, 411), à l'inverse, aucun effet significatif n'a été observé pour CS- réponses évoquées (six rats p > 0,05).

L'ampleur de l'activité évoquée CS + dans les terminaux préfrontaux au sein de l'ER augmente parallèlement à la formation de l'association de stimulus. ( a ) Terminaux préfrontaux (région prélimbique [PrL]) exprimant GCaMP6f. ont été enregistrées au sein du RE. (b) Gauche : valeurs ΔF/F moyennées sur les trois premiers jours de conditionnement. A droite : comme à gauche mais pour les trois derniers jours de conditionnement. Les lignes noires verticales représentent le début et la fin du CS. Les zones ombrées indiquent ± SEM. (c) Gauche : valeurs ΔF/F moyennes des terminaux préfrontaux dans le RE en réponse au CS+ au cours des jours de conditionnement (axe y, descendant de haut en bas), tracées en fonction du temps (axe x). Les lignes blanches verticales représentent le début et la fin du CS+. Droite : idem gauche mais pour le CS-. ( d ) AUC moyenne dans une fenêtre de deux secondes immédiatement après la présentation du CS, tracée en fonction des jours de conditionnement (* p <0, 05, interaction Session × Type CS). Les barres d'erreur indiquent ± SEM.

Dans une cohorte distincte de sept rats, nous avons enregistré l'activité calcique des terminaux préfrontaux dans le MD au cours de séances de conditionnement quotidiennes (Fig. 5a). Les terminaux préfrontaux au sein du MD ont montré des réponses plus fortes au CS + qu'au CS- à partir de la première session (Fig. 5b, c). La différence dans l'ampleur de la réponse entre le CS+ et le CS- est apparue plus nette lors des sessions suivantes, principalement en raison de l'augmentation des réponses au CS+. Cependant, ces impressions visuelles n'ont pas été confirmées par l'analyse statistique appliquée aux valeurs AUC (Fig. 5d, ANOVA RM bidirectionnelle, interaction Session × Type CS, F(9,54) = 0,869, p = 0,586 ; Session, F (9,54) = 1,530, p = 0,161 ; type CS, F(1,6) = 9,000, p = 0,024). Nos résultats suggèrent que bien que le CS + ait évoqué une plus grande sortie préfrontale à la fois pour le RE et le MD, par rapport au CS-, l'évolution de cette sortie a différé entre les deux régions du cerveau. Principalement, la sortie préfrontale vers le RE s'est renforcée au fil des jours de conditionnement, tandis que la sortie vers le MD est devenue plus forte pour le CS + le premier jour de conditionnement et s'est maintenue de manière stable les jours suivants.

Le CS+ a évoqué une plus grande activité dans les terminaux préfrontaux au sein du MD par rapport au CS- dès la première séance de conditionnement. ( a ) Terminaux préfrontaux (région PrL) exprimant GCaMP6f. ont été enregistrées dans le MD. (b) Gauche : valeurs ΔF/F moyennées sur les trois premiers jours de conditionnement. A droite : comme à gauche mais pour les trois derniers jours de conditionnement. Les lignes noires verticales représentent le début et la fin du CS. Les zones ombrées indiquent ± SEM. (c) Gauche : valeurs ΔF/F moyennes des terminaux préfrontaux dans le MD en réponse au CS+ au cours des jours de conditionnement (axe y, descendant de haut en bas), tracées en fonction du temps (axe x). Les lignes blanches verticales représentent le début et la fin du CS+. Droite : idem gauche mais pour le CS-. ( d ) AUC moyenne dans une fenêtre de deux secondes immédiatement après la présentation du CS tracée en fonction des jours de conditionnement (* p <0, 05, effet principal du type de CS). Les barres d'erreur indiquent ± SEM.

Pour comparer plus directement les différences entre la sortie préfrontale vers le RE et le MD, nous avons divisé l'AUC évoquée par le stimulus moyennée sur les trois derniers jours de conditionnement avec l'AUC évoquée par le stimulus avant le conditionnement (Session 0). Cette AUC normalisée a quantifié le changement relatif de l'activité terminale évoquée par CS avant et après l'apprentissage associatif. Le changement de la réponse évoquée CS + était significativement plus important dans les terminaux du RE que dans ceux du MD (Fig. 6a, ANOVA mixte à deux facteurs, interaction Groupe × Type CS, F (1, 11) = 4, 942, p = 0, 048; Groupe, F(1,11) = 2,297, p = 0,158 ; Type CS, F(1,11) = 10,508, p = 0,008. Test t non apparié de suivi, t11 = 2,320, p = 0,041). En revanche, la variation des réponses évoquées par CS était comparable entre les terminaux du RE et du MD (t11 = 0,535, p = 0,603). Ces résultats suggèrent que la formation d'associations de stimulus a entraîné une plus grande augmentation de la sortie préfrontale vers le RE que vers le MD.

La formation de l'association CS+US s'accompagne d'une augmentation plus forte de l'activité évoquée CS+ dans les terminaux préfrontaux au sein du RE par rapport au MD. ( a ) Comparaison de l'AUC évoquée par CS + et CS entre les terminaux préfrontaux au sein du RE (N = 6) et du MD (N = 7, * p <0, 05). L'AUC a été moyennée au cours des trois derniers jours de conditionnement et normalisée à l'aide des valeurs d'AUC évoquées du CS de la session 0. Les barres d'erreur indiquent ± SEM. ( b ) Corrélations de CR% avec CS évoqué AUC chez deux rats représentatifs. Les points à l'intérieur de chaque graphique représentent le % de RC pour les essais CS+ ou CS- tracé par rapport à la valeur de l'ASC pour le même type d'essai sur les 10 sessions. En haut : fibre de rat RE. En bas : rat fibre MD (*p < 0,05). ( e ) Comparaison des coefficients de corrélation moyens entre CR% et AUC (RE, N = 6; MD, N = 7). Les barres d'erreur indiquent ± SEM.

Pour resserrer davantage la relation entre les sorties thalamiques préfrontales et l'apprentissage associatif, nous avons calculé le coefficient de corrélation de Pearson (r) entre les valeurs AUC et CR% pour les deux types de CS au cours des 10 séances de conditionnement. Sur les six rats RE, trois ont montré une corrélation positive significative (p <0, 05) entre l'amplitude de la réponse et le % CR (Fig. 6b). Sur les sept rats MD, trois ont montré une corrélation positive significative. En tant que groupe (Fig. 6c), les valeurs R étaient significativement différentes de zéro dans les groupes RE (test t à un échantillon, t5 = 3,720, p = 0,014) et MD (t6 = 9,056, p = 0,001). Les valeurs R étaient également comparables entre les groupes RE et MD (test t non apparié, t11 = 0,713, p = 0,491). Ainsi, les sorties préfrontales vers le RE et le MD étaient sélectives pour les associations de stimulus ; cependant, seules les sorties préfrontales au RE ont montré une plus grande amélioration de la sélectivité associative avec l'apprentissage.

L'accumulation de preuves provenant d'études comportementales a montré que le RE, en particulier la voie mPFC-to-RE, joue un rôle important dans les processus de formation de la mémoire qui reposent sur une communication étroite entre le mPFC et le HPC22,23,24. Cependant, des études antérieures n'ont pas étudié dans quelle mesure les sorties de mPFC vers le RE sont modulées par les caractéristiques sensorielles et relationnelles des stimuli de tâche. En surveillant l'activité des projections préfrontales se terminant par le RE, nous avons constaté que l'activité terminale préfrontale n'était fortement activée par un stimulus qu'après que le stimulus soit devenu associé à un résultat aversif. L'ampleur de l'activité terminale évoquée par le stimulus était positivement corrélée avec la force de l'association du stimulus appris. De plus, l'augmentation des réponses terminales liée à l'apprentissage était plus importante dans le RE que dans une autre cible de sortie thalamique, le MD. Cela met en évidence le rôle unique de la voie mPFC-à-RE dans l'acheminement des informations liées à la pertinence comportementale des stimuli sensoriels lors de l'apprentissage associatif.

Nos enregistrements photométriques ont démontré que les terminaux préfrontaux au sein du RE n'étaient pas activés en réponse aux stimuli auditifs et visuels présentés par eux-mêmes (Session 0; Fig. 2e, f). Avec l'apprentissage, cependant, ils sont devenus fortement activés par l'un des stimuli associés à un choc de la paupière, mais pas par l'autre stimulus présenté seul (Fig. 4d). Ces résultats suggèrent que le changement détecté dans la sortie mPFC-RE est attribuable à l'apprentissage associatif, mais pas à la sensibilisation à des stimuli sensoriels présentés à plusieurs reprises. Des schémas d'activité différentielle similaires ont déjà été rapportés pour l'activité oscillatoire mPFC17,18 et de pointe12,14,15,50,51. De plus, une manipulation qui améliore cette activité différentielle facilite la formation d'associations de stimulus16,17. Collectivement, ces résultats suggèrent que le mPFC joue un rôle essentiel dans la détection et le codage des associations de stimulus pertinentes52. Les présents résultats étendent cette notion en démontrant que la pertinence détectée est acheminée vers l'ER.

Lorsque le RE était pharmacologiquement inactivé, les rats étaient incapables de former l'association entre le stimulus et le résultat aversif, mais n'augmentaient pas leurs réponses à l'autre stimulus présenté seul (Fig. 1d). Ces modèles indiquent que le RE est nécessaire pour la formation d'associations de stimulus, mais pas pour la discrimination sensorielle. La présente observation est cohérente avec les rapports précédents selon lesquels la perturbation de l'ER via le muscimol53 ou la stimulation électrique à haute fréquence40 altérait l'acquisition de la mémoire dans la peur des traces et le conditionnement des clignements des yeux, respectivement. Dans le même temps, même avec l'inactivation du RE, les rats montraient encore un faible degré d'apprentissage associatif. Ceci est probablement le résultat d'une inactivation incomplète du RE, car le RE s'étend loin sur l'axe antérieur-postérieur, ce qui est au-delà de la propagation de notre muscimol infusé.

Compte tenu de la sélectivité des projections préfrontales dans le RE pour la pertinence comportementale des événements sensoriels, les déficits d'apprentissage observés après l'inhibition du RE pourraient être dus à la privation du HPC du signal de pertinence mPFC. Alternativement, l'inhibition du RE pourrait également perturber la synchronisation de l'activité neuronale entre le mPFC et le HPC, qui est connue pour jouer un rôle essentiel dans l'apprentissage associatif temporel19,54. Chez les rats anesthésiés à l'uréthane, l'inactivation du RE a perturbé à la fois la structuration temporelle de l'éclatement gamma (GB) et sa synchronicité entre le mPFC et CA1 ; cependant, la fréquence de ces événements GB dans les deux régions n'a pas été affectée30. Plus récemment, nous avons constaté que le taux d'incidence de mPFC GB pendant les intervalles de trace dans le DTEBC était positivement corrélé avec l'acquisition de tâches18. Si un GB similaire se produit également dans CA1 en même temps, l'inhibition RE peut perturber leur synchronisation, entraînant une communication mPFC-HPC interrompue. De plus, comme nous n'avons pas inhibé sélectivement les projections mPFC-à-RE, l'apprentissage altéré avec l'inhibition RE peut être dû à la perturbation du transfert d'informations et/ou des effets modulateurs du HPC dorsal au mPFC via le RE.

Parallèlement à son rôle dans le gating d'informations, plusieurs travaux utilisant des tâches contextuelles de conditionnement de la peur ont soutenu que l'ER contrôle également la précision des souvenirs contextuels de la peur35,36,37,38. Plus précisément, l'inactivation de la sortie de mPFC vers le RE ou le silence direct des projections RE a conduit à l'acquisition d'une mémoire de peur qui manquait de sélectivité pour le contexte de conditionnement d'origine35. Notamment, les souvenirs contextuels imprécis acquis pendant les périodes d'inactivation de l'ER sont acquis indépendamment de l'hippocampe36. Dans le conditionnement contextuel de la peur, les sujets dont la fonction hippocampique est réduite forment une association élémentaire du choc au pied avec un simple signal environnemental mais pas avec des représentations détaillées de l'environnement de conditionnement, ce qui entraîne la perte de spécificité contextuelle55,56. Par conséquent, le rôle apparent de RE dans le contrôle de la précision de la mémoire peut être une manifestation de son rôle plus général dans la modulation de l'engagement du HPC dans le codage de la mémoire36. Cette idée cadre bien avec les déficits d'apprentissage observés dans notre tâche. Plus précisément, dans TEBC, le HPC est nécessaire pour combler le fossé temporel entre le CS et les États-Unis, qui ne peut être contourné en engageant une stratégie d'apprentissage de bas niveau1,2,3. Ainsi, l'inhibition du RE a entraîné une acquisition de CR altérée (Fig. 1d) car elle ne pouvait pas engager de manière adéquate le HPC pendant le conditionnement. Nos données de photométrie ont encore élargi cette idée en suggérant que cette fonctionnalité du RE est contrôlée par la sortie mPFC signalant la pertinence des événements en cours.

Le MD est réciproquement connecté avec le mPFC41,42,43 mais manque de projections vers et depuis le HPC44,45. Cette caractéristique anatomique nous a amenés à contraster les sorties préfrontales entre le MD et le RE, révélant plusieurs qualités uniques aux projections mPFC vers le MD. Premièrement, les terminaux préfrontaux du MD étaient fortement activés par des stimuli sensoriels avant le début du conditionnement. Deuxièmement, une fois le conditionnement commencé, les sorties préfrontales vers le MD différenciaient CS + et CS- avant que les rats ne développent des CR différentiels (Fig. 3b et 5d). De plus, l'ampleur de la réponse n'a pas augmenté au cours des séances de conditionnement suivantes. Sur la base de ces résultats, nous soutenons que la boucle entre le mPFC et MD aide à maintenir les représentations de stimulus dans le mPFC pendant les intervalles de stimulus-résultat, comme proposé dans diverses formes de tâches de mémoire de travail45,57,58,59,60,61,62. Par exemple, les terminaux MD dans le mPFC sont nécessaires pour le déclenchement soutenu des neurones mPFC pendant la période de retard d'une non-correspondance retardée à l'échantillon T-maze task57. De plus, dans une autre tâche de MW nécessitant le maintien d'un signal sensoriel sur une période de retard pour une sélection de choix basée sur des règles ultérieures, l'activité MD de la période de retard s'est avérée dépendante des entrées des neurones mPFC sélectifs des signaux58,61. Ces études mettent en évidence l'importance des projections MD pour le mPFC dans le maintien d'informations pertinentes sur le plan comportemental et la dépendance du MD à l'égard de la sortie mPFC évoquée par le stimulus pour initier ce processus. Sur cette base, des stimuli nouveaux ou éventuellement pertinents devraient susciter une sortie de mPFC vers le MD, car l'animal aurait besoin de maintenir le stimulus dans un état actif pour évaluer s'il est suffisamment pertinent sur le plan comportemental pour justifier son engagement envers la mémoire. Ce point de vue corrobore également les résultats d'études dans lesquelles les lapins présentant des lésions MD nécessitaient un plus grand nombre de séances de conditionnement pour former l'association de stimulus par rapport aux témoins non lésés dans TEBC63, tandis que les performances dans le conditionnement du clignement des yeux, qui n'a pas d'intervalle de trace, ne sont que minimes. , le cas échéant, affecté64,65.

Nos résultats ici ont identifié des dissociations fonctionnelles entre deux voies préfrontales-thalamiques majeures en découvrant l'augmentation induite par l'apprentissage de la sortie préfrontale vers l'ER, indiquant que les informations émises vers l'ER signalent les caractéristiques relationnelles des stimuli sensoriels. Les études futures devront étudier quel type d'information est envoyé du RE au HPC et comment cela affecte le traitement neuronal hippocampique soutenant l'apprentissage associatif temporel.

Toutes les données générées et analysées dans cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ce travail a été soutenu par la Subvention à la découverte du CRSNG (RGPIN-2020-04479) et le Fonds d'opportunité pour les leaders de la FCI (25026; [KT-N.]), et le programme de bourses d'études supérieures au doctorat du CRSNG (PGSD2-535097; [XY]) .

Département de biologie cellulaire et des systèmes, Université de Toronto, Toronto, Canada

Xiaotian Yu & Kaori Takehara-Nishiuchi

Programme de biologie humaine, Université de Toronto, Toronto, Canada

Sable de Jembere

Département de psychologie, Université de Toronto, Toronto, Canada

Kaori Takehara-Nishiuchi

Programme collaboratif en neurosciences, Université de Toronto, Toronto, Canada

Xiaotian Yu & Kaori Takehara-Nishiuchi

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Conception expérimentale par XY et KT-N. ; toutes les chirurgies et expériences menées par XY avec FJ aidant à l'histologie ; toutes les données analysées par XY sous la direction de KT -N. ; premier brouillon du manuscrit rédigé par XY et KT -N.; manuscrit édité par tous les auteurs; manuscrit finalisé préparé par XY et KT -N.

Correspondance à Kaori Takehara-Nishiuchi.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Yu, X., Jembere, F. & Takehara-Nishiuchi, K. Les projections préfrontales vers le noyau reuniens signalent la pertinence comportementale des stimuli pendant l'apprentissage associatif. Sci Rep 12, 11995 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-15886-0

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Reçu : 02 mai 2022

Accepté : 30 juin 2022

Publié: 14 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-15886-0

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